摘要：本研究的目的是解決穿透性角膜移植術(shù)后早衰對角膜內(nèi)皮細(xì)胞的影響的問題。因為供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞的質(zhì)量對角膜移植的成功很重要.

 

關(guān)鍵詞：氧化應(yīng)激  早衰  角膜內(nèi)皮細(xì)胞  穿透性角膜移植術(shù)

 

介紹：人角膜內(nèi)皮細(xì)胞（HCECs）形成一個再生潛力有限的單層膜，這些細(xì)胞通過離子泵機理保持基質(zhì)脫水。在過去的50年中，穿透性角膜移植術(shù)（PKP）是角膜內(nèi)皮特異性功能障礙疾病的標(biāo)準(zhǔn)治療。而不是更換整個角膜，角膜內(nèi)皮移植術(shù)（EK）與后基質(zhì)移植盤 或內(nèi)皮取代患者的內(nèi)皮細(xì)胞。這個相對較新的程序已經(jīng)徹底改變了血管內(nèi)皮細(xì)胞的疾病的治療。供者角膜內(nèi)皮細(xì)胞的質(zhì)量對角膜移植手術(shù)的成功具有重要的作用。供者內(nèi)皮細(xì)胞的狀態(tài)可能是移植后透明度和長期生存的必要條件。隨著時間的推移內(nèi)皮細(xì)胞損失，角膜移植術(shù)后角膜混濁，移植后五年變成實質(zhì)。目前很少有了解加速術(shù)后血管內(nèi)皮細(xì)胞的損失的機制。DNA斷裂和氧化損傷引起的環(huán)境惡化，遺傳缺陷或內(nèi)源性過程屬于某些類型的DNA損傷?；钚匝跻鸬难趸瘧?yīng)激的關(guān)鍵作用之一是誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。大量研究顯示：過早衰老與器官移植有關(guān)，如腎移植。細(xì)胞衰老是一種不可逆的生長停滯狀態(tài)。它可由多種致癌或緊張刺激包括端?？s短，INK4a/ARF位點的表觀遺傳學(xué)阻遏觸發(fā)。HCECs臨床結(jié)果研究表明，DNA氧化損傷和氧化應(yīng)激影響HCECs增殖能力。也觀察到，體外角膜內(nèi)皮細(xì)胞的衰老，年齡相關(guān)的相對增殖能力和衰老特征不是由于衰老的端粒縮短導(dǎo)致的。研究表明，蛋白激酶活性是氧化還原敏感的因為在這些關(guān)鍵蛋白的半胱氨酸殘基可以通過氧化劑進行翻譯后修飾。多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路同細(xì)胞衰老和細(xì)胞死亡相關(guān)，包括p38 MAPK通路。此外，細(xì)胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）是應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老機制的一個關(guān)鍵因素。據(jù)報道，應(yīng)激激活A(yù)SK1加速糖尿病患者內(nèi)皮細(xì)胞衰老。該ask1-p38 MAPK通路的抑制作用對預(yù)防血管老化和治療神經(jīng)退行性疾病和心臟疾病用可能是有用的。而ask1-p38 MAPK信號通路相關(guān)的細(xì)胞早衰在穿透性角膜移植術(shù)后角膜內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)病機制還不是很清楚。

 

方法：動物與正常風(fēng)險的原位角膜移植：6-8周齡BALB/c（H-2d）小鼠和C57BL／6小鼠（H-2b），體重18～20 g，從中國科學(xué)院動物研究所獲得。小鼠隨機分為兩組，同系和同種異體組，每組20只。角膜移植的方法如前所述。雄性C57BL／6小鼠作為供體，同齡的雄性BALB/c小鼠作為受體。同系移植雄性Balb/c小鼠作為供、受體程序的結(jié)果進行比較。局部或全身均沒有使用免疫抑制藥物。每只動物只有右眼用于角膜移植，左眼不受干擾。角膜移植術(shù)后4.5個月采集移植片，從移植片分離角膜內(nèi)皮細(xì)胞。PCR分析，將樣品分為6組（SP1、SP2、SP3、AP1、AP2和AP3）每組包括三個角膜內(nèi)皮細(xì)胞樣本。Western blot分析，樣品分成6組（SW1、SW2、SW3，AW1，AW2和aw3）每組包括兩個角膜內(nèi)皮細(xì)胞樣本。

 

小鼠角膜移植的臨床評價，用臺盼藍(lán)和茜素紅S角膜內(nèi)皮細(xì)胞雙重染色，免疫組化：小鼠角膜移植后每周進行一次裂隙燈顯微鏡檢查連續(xù)兩周。移植物的不透明度用1-5來區(qū)分。接受兩個連續(xù)的分?jǐn)?shù)為3，角膜移植被認(rèn)為是失敗的。所有的檢查都是由兩個雙盲的觀察者進行的。臺盼藍(lán)和茜素紅S對角膜內(nèi)皮細(xì)胞進行雙染色。角膜樣品被固定在冷甲醇中，樣品使用elivision?試劑盒進行染色。根據(jù)說明書，使用熒光E800顯微鏡觀察。

 

基于實時PCR的陣列分析：采用Nucleospin RNA II系統(tǒng)純化小鼠角膜內(nèi)皮細(xì)胞總RNA。使用PrimeScript第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA第一鏈（1μg/μL）。實時PCR陣列和數(shù)據(jù)分析使用RT2探查?PCR檢測小鼠氧化應(yīng)激和抗氧化防御PCR陣列。

 

患者組織樣品采集：從角膜移植失敗患者上收集15個新鮮的功能失調(diào)角膜扣（直徑7.25至8毫米）。進一步的樣品制備后，選擇了五個樣品進行分析。由山東（青島）的眼科銀行國際聯(lián)合會提供的器官捐贈者的性別匹配的正常人角膜樣本作為對照組。3個樣品用于SA-β-Gal染色（21，25，19歲），四個樣品用于基因表達(dá)譜（21歲，27，30歲和31歲）。五個樣品（3個22歲和2個25歲）用于HECEs培養(yǎng)。穿透性角膜移植術(shù)圓鉆取供體角膜后剩余部分全周內(nèi)皮組織被立即收集用于實驗。所有樣品均在4°C的角膜存儲介質(zhì)中保存，直到實驗前。

 

RNA提取與基因表達(dá)譜研究：總RNA使用RNA II系統(tǒng)純化，根據(jù)試劑盒說明，使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA合成?；虮磉_(dá)譜的研究，包括標(biāo)記、雜交、掃描，正?；?，和數(shù)據(jù)分析。

 

人角膜內(nèi)皮細(xì)胞（HCECs）培養(yǎng)和治療：正常角膜供體五個角膜緣樣品被用于進行HCECs培養(yǎng)。后彈力膜與內(nèi)皮完整仔細(xì)地剝離，培養(yǎng)前然后用optimem-i添加10% FBS過夜穩(wěn)定細(xì)胞。離心后，內(nèi)皮層組織0.02%的EDTA溶液孵育37°C 1小時細(xì)胞懸浮于含8%胎牛血清的培養(yǎng)基optimem-i，5ng/ml 表皮生長因子 (EGF) 20ng/ml的，神經(jīng)生長因子（NGF），100g/ml的垂體提取物, 20g/ml的抗壞血酸，200 mg/L的氯化鈣，0.08%的硫酸軟骨素，50g/ml的慶大霉素，抗菌/抗真菌溶液稀釋1 / 100。37°C, 5%二氧化碳孵育箱培養(yǎng)。在37°C, 培養(yǎng)的上皮細(xì)胞在不同的過氧化氫濃度（0至100μM）經(jīng)過不同的時間（0min、1h、2h和6h）處理。無過氧化氫處理的細(xì)胞作為對照組。此外，HCECs也用SB203580（10μM）和無SB203580處理細(xì)胞作對照組。

 

衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（SA-β-GAL）活性染色：用4%的甲醛對人的角膜進行整體固定（與內(nèi)皮細(xì)胞側(cè)）。在37°C該組織使用的衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒過夜孵育。染色可視化和使用配備數(shù)碼相機的顯微鏡拍照。

 

免疫熒光染色：為了免疫熒光染色，小鼠角膜組織與內(nèi)皮側(cè)被放置在4%PFA溶液進行固定。然后，4°C樣品與原抗體孵育過夜（p-ask1和p-p38）。用PBS洗滌后，樣品與FITC標(biāo)記的二抗共孵育1 h（1:100）。細(xì)胞用DAPI復(fù)染，顯微鏡下觀察。

 

 

結(jié)果：穿透性角膜移植術(shù)后角膜植片內(nèi)皮細(xì)胞早衰：三次使用正常風(fēng)險的原位小鼠角膜移植模型（共60只），評估了內(nèi)皮細(xì)胞早衰。三次收集了8，11，和10角膜移植。每一次，兩組的四個角膜移植被用于染色的檢測。一角膜移植片分為三塊，一塊是用臺盼藍(lán)和茜素紅S對角膜內(nèi)皮細(xì)胞染色。其他被用于SA -β- Gal染色和8-OHdG免疫組化分析。小鼠角膜移植與角膜內(nèi)皮細(xì)胞的臨床評價結(jié)果見圖。內(nèi)皮細(xì)胞最初的六角形結(jié)構(gòu)保持在同系組。異體組的角膜移植的內(nèi)皮細(xì)胞的邊界是不透明的，多出現(xiàn)在同種異體組。SA -β-Gal陽性細(xì)胞出現(xiàn)在同種異體角膜移植組的內(nèi)皮細(xì)胞，而同系移植組角膜植片內(nèi)皮細(xì)胞均未觀察到SA -β-Gal陽性細(xì)胞。相比角膜內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿，在核內(nèi)觀察到較高的8-OHdG表達(dá)。同種異體角膜移植核組8-OHdG表達(dá)明顯高于同系組。

 

Western blot分析比較角膜植片內(nèi)皮細(xì)胞p16INK4a的表達(dá)，p21WAF1/CIP1和p53蛋白。與同系移植相比，同種異體移植的角膜內(nèi)皮細(xì)胞p16INK4a，p21Waf1/Cip1和p53蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)。

 

小鼠氧化應(yīng)激和抗氧化rt2-pcr陣列被用來研究穿透性角膜移植術(shù)后角膜移植的內(nèi)皮細(xì)胞氧化抗氧化失衡。如有表達(dá)兩倍以上的變化，P?<?0.05，被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。檢測的84個基因，27個轉(zhuǎn)錄（32%）下調(diào)，其中，17個表達(dá)兩倍以上的水平下調(diào)和11（13%）個較高的表達(dá)，如三維輪廓和散點圖顯示。較低水平表達(dá)的基因中，有23個抗氧化基因有統(tǒng)計意義。編碼谷胱甘肽過氧化物酶7（GPx7）、乳過氧化物酶（LPO）和NADPH氧化酶1（Nox1）基因表達(dá)水平較低分別為4.48-fold、4.32和4.14-fold。分別是同種異體角膜內(nèi)皮細(xì)胞與自體角膜內(nèi)皮細(xì)胞比較的結(jié)果。在同種異體角膜標(biāo)本，Western blot檢測GPx7，LPO和Nox1表達(dá)分別為2.22-fold， 2.38-fold和9.10-fold水平較低。同種異體角膜標(biāo)本內(nèi)皮，GPX3和Gat分別比同源角膜的內(nèi)皮細(xì)胞樣品高1.17-fold和1.58-fold水平。結(jié)果表明ROS積累和ASK1/p38小鼠模型信號通路的活化。升高的活性氧水平可能是氧化-抗氧化失衡的結(jié)果。正常人角膜內(nèi)皮細(xì)胞相比，角膜移植術(shù)后角膜內(nèi)皮細(xì)胞觀察到更多的SA -β-Gal陽性細(xì)胞。這些結(jié)果與在小鼠模型中的結(jié)果是一致的。

 

通過ask1-p38 MAPK途徑HCECs氧化應(yīng)激，ROS水平升高， CDK抑制劑上調(diào)和ROS介導(dǎo)p16 INK4a上調(diào)：鑒于角膜移植的內(nèi)皮細(xì)胞參與了氧化-抗氧化不平衡，我們開發(fā)了體外實驗?zāi)Ｐ?，使用過氧化氫處理模擬氧化應(yīng)激狀態(tài)。人角膜內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)與功能相關(guān)指標(biāo)如Na+ K+ ATP酶和ZO-1以及Prdx6。對細(xì)胞內(nèi)活性氧和線粒體活性氧的積累進行了比較。100μM過氧化氫處理HCECs M60分鐘后觀察ROS的產(chǎn)生。數(shù)據(jù)表明，細(xì)胞內(nèi)ROS水平在過氧化氫處理過的HCECs比未經(jīng)處理的細(xì)胞高得多。SA -β-Gal的陽性率也在和100μM 過氧化氫處理HCECs60分鐘后觀察到。要確定是否過氧化氫處理后HCECs線粒體ROS的產(chǎn)生增強，采用MitoSOX紅，MitoTracker綠色調(diào)頻的定位術(shù)。由Mito Tracker Green的定位顯示，與對照組HCECs比較，過氧化氫處理的細(xì)胞中線粒體呈紅色熒光，表明增加線粒體產(chǎn)生活性氧。

 

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）抑制劑被認(rèn)為在細(xì)胞周期阻滯和早衰方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此我們研究了在HCECs活性氧對CDK的抑制水平，包括p16INK4a、p21Cip1和p27Kip1。2小時100μM 過氧化氫處理后，在HCECsp16INK4a、p21Cip1和p27kip1 mRNA表達(dá)水平上調(diào)。通過Western blot分析，我們也檢測p16INK4a、p21Cip1和p27Kip1蛋白的表達(dá)水平。100μM 過氧化氫處理HCECs后，p16INK4a、p21Cip1和p27Kip1蛋白表達(dá)水平升高，而這種上調(diào)堅持過氧化氫處理后2至6小時。

 

是否過氧化氫誘導(dǎo)的HCECs衰老與ask1-p38 MAPK通路的活性有關(guān)，蛋白質(zhì)印跡分析測定ASK1的蛋白質(zhì)水平或磷酸化ASK1。體外對過氧化氫處理和未處理的HCECs進行p38 MAPK的活化比較。在過氧化氫處理后HCECs的ASK1和p38 MAPK的磷酸化水平顯著增加。對體外培養(yǎng)的上皮細(xì)胞，使用siRNA特異沉默ASK1和SB203580，廣泛使用的p38抑制劑，探討過氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老的分子機制。通過Western blot分析，我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染ASK1 siRNA后ASK1表達(dá)下調(diào)，在HCECASK1 siRNA s也降低MAPK活性。

 

結(jié)論：我們的觀察表明ROS標(biāo)志物（氧化防御基因），和衰老標(biāo)志物（與衰老有關(guān)的SA-β-Gal和蛋白質(zhì)如p16INK4a / P21WAF1/CIP1 / p53）表達(dá)水平升高。還發(fā)現(xiàn)，在這種情況下，p38MAPK和ASK1通路被激活的證據(jù)。這些觀測數(shù)據(jù)將與活性氧通路>p38/ASK1>衰老一致。反過來說明在角膜同系移植過程中發(fā)生SIPS過程。我們的研究結(jié)果將為角膜移植術(shù)后功能障礙的分子發(fā)病機制提供新的見解。