摘要：視網(wǎng)膜脫離（RD）是導(dǎo)致失明的主要原因，雖然通過手術(shù)再附著率有很大提高，許多黃斑脫落視覺結(jié)果令人失望的，主要原因是感光細(xì)胞死亡。以前發(fā)現(xiàn)，在嚙齒類動(dòng)物的缺血/再灌注損傷模型中，葉黃素有抗凋亡作用。本研究的目的是調(diào)查葉黃素作為手術(shù)的一種可能輔助藥物。

 

方法：SD大鼠視網(wǎng)膜下注射1.4%透明質(zhì)酸鈉用于誘導(dǎo)視網(wǎng)膜脫落直至脫落約70%。誘導(dǎo)RD后4h內(nèi)，每日腹腔注射玉米油（對(duì)照組）或含0.5mg/kg葉黃素玉米油（治療組）。在視網(wǎng)膜脫落后第3天和第30天被安樂死，采用TUNEL染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)視網(wǎng)膜切片分析其視網(wǎng)膜外核層（ONL）感光細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活。通過免疫組化對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）和視紫紅質(zhì)（Rho）的表達(dá)進(jìn)行分析。用抗激活型Caspase-3、激活型Caspase-8和激活型Caspase-9抗體進(jìn)行的免疫印跡劃定葉黃素在細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。為尋求一個(gè)可能的治療時(shí)間，相同的一組重復(fù)治療實(shí)驗(yàn)在視網(wǎng)膜脫落（RD）后36小時(shí)開始。

 

結(jié)果：RD后4h 給予葉黃素，與賦形劑組相比，RD后3天視網(wǎng)膜外核層有較少的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示視網(wǎng)膜葉黃素治療30天視網(wǎng)膜外核層有明顯的核。治療組也顯著減少GFAP免疫反應(yīng)和保存的Rho激酶的表達(dá)。RD后3天，免疫印跡顯示治療組的激活型Caspase-3和激活型Caspase-8表達(dá)減少。激活型Caspase-9沒明顯變化。在RD后36h時(shí)給予葉黃素，也觀察到類似的結(jié)果。

 

結(jié)論：研究結(jié)果表明，葉黃素是一種有效的神經(jīng)保護(hù)劑，可以補(bǔ)救RD大鼠的感光細(xì)胞，至少在視網(wǎng)膜脫落36h內(nèi)有效。葉黃素可以作為RD病人術(shù)后輔助藥物，來改善視覺效果。

 

關(guān)鍵詞：細(xì)胞凋亡  葉黃素  透明之酸鈉  視網(wǎng)膜神經(jīng)元 視網(wǎng)膜脫落  葉黃素的神經(jīng)保護(hù)作用

 

介紹：視網(wǎng)膜脫離（RD），定義為視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層與底層的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分離，可造成毀滅性的視覺損失。隨著外科技術(shù)的進(jìn)步，復(fù)位率大大增加，尤其是多次手術(shù)后。然而，最終的視覺效果仍然令人失望，尤其涉及視網(wǎng)膜黃斑脫離。即使全視網(wǎng)膜復(fù)位，術(shù)后視力長(zhǎng)期維持在0.2到0.4的范圍內(nèi)。感光細(xì)胞凋亡已被假定為視覺損失的主要原因，除了在視網(wǎng)膜上的其他結(jié)構(gòu)的變化，如神經(jīng)膠質(zhì)疤痕。為達(dá)到更好的視覺效果，防止或減少感光細(xì)胞死亡的神經(jīng)保護(hù)作用也因此成為了研究的重點(diǎn)。

 

葉黃素，類胡蘿卜素類色素，通過長(zhǎng)期的、大規(guī)模的隨機(jī)、安慰劑對(duì)照試驗(yàn)已被證明對(duì)降低年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）風(fēng)險(xiǎn)有效。Krinsky回顧了葉黃素和玉米黃質(zhì)對(duì)防止眼睛黃斑變性的生物學(xué)機(jī)制。此后，葉黃素已被作為一種抗氧化劑和抗炎劑的神經(jīng)保護(hù)劑在不同的疾病模型中被研究，包括糖尿病性視網(wǎng)膜病變，葡萄膜炎，視網(wǎng)膜光損傷與缺血/再灌注損傷。葉黃素已被證明，不僅對(duì)RPE細(xì)胞有效，而且對(duì)其他細(xì)胞成分包括神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，內(nèi)叢狀核，甚至感光細(xì)胞有效。葉黃素也被證明有抗氧化功能。它吸收藍(lán)光，包含雙鍵，淬滅活性氧，減少氧化應(yīng)激?；钚匝跚宄齽┖涂寡趸瘎┛赡軐?duì)RD有保護(hù)作用。RD，底層的神經(jīng)視網(wǎng)膜RPE分離剝奪了感光細(xì)胞的氧氣和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，誘導(dǎo)缺氧環(huán)境下活性氧和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致感光細(xì)胞死亡。葉黃素保護(hù)感光細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

 

方法：動(dòng)物和研究設(shè)計(jì)：選用雄性SD大鼠（200-250g），飼養(yǎng)在溫控房間內(nèi)，大鼠被分層兩組，治療組接受含葉黃素的玉米油和一個(gè)賦形劑組接受玉米油。右眼（OD）誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜脫離，而左眼（OS）作為對(duì)照組。進(jìn)行四個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)：前兩個(gè)評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜脫離后4h給予葉黃素的短期和長(zhǎng)期的影響.后兩個(gè)評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜脫離后36h給予葉黃素的短期和長(zhǎng)期的影響。

 

視網(wǎng)膜脫落實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停捍笫蟾骨蛔⑸浼妆洁玎海? mg/kg）和氯胺酮（70 mg/kg）混合劑麻醉。局部麻醉（1%鹽酸丙美卡因）和散瞳劑（1%托吡卡胺）應(yīng)用到右眼。做一個(gè)小的角膜切除術(shù)是為了在這個(gè)過程中釋放眼壓。在手術(shù)顯微鏡下觀察眼底，凝膠4000應(yīng)用于眼。大鼠右眼睛鞏膜和視網(wǎng)膜上邊緣下約2毫米，用30號(hào)針頭機(jī)械性誘導(dǎo)視網(wǎng)膜脫離。通過模擬視網(wǎng)膜裂孔的視網(wǎng)膜切開術(shù)，針然后縮回到視網(wǎng)膜下的空間，透明質(zhì)酸鈉被注入直到引起70%的視網(wǎng)膜脫落，模仿孔源性視網(wǎng)膜脫落。手術(shù)顯微鏡下進(jìn)行檢查，并為每一只動(dòng)物拍攝一張眼底照片。預(yù)防性抗生素（妥布霉素軟膏）被應(yīng)用于預(yù)防術(shù)后感染。動(dòng)物進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)直到他們恢復(fù)意識(shí)及進(jìn)行日常術(shù)后護(hù)理。

 

治療：20%葉黃素玉米油懸浮液。治療組 用純玉米油將濃度0.5mg/kg葉黃素稀釋至0.3mg/ml。賦形劑組給予相當(dāng)數(shù)量的玉米油，所有治療均給予腹腔內(nèi)注射。

 

組織收集與處理：在不同的時(shí)間點(diǎn)，用過量戊巴比妥鈉處死動(dòng)物。檢查眼睛視網(wǎng)膜脫落的高度和用6-0可吸收縫合線被縫合到每只眼的鼻結(jié)膜來標(biāo)記解剖位置。摘除眼球，角膜和晶狀體被仔細(xì)移除。在4°C，用4%多聚甲醛在磷酸鹽緩沖液（PBS， 0.01M，pH 7.4）固定眼球。使用乙醇和氯仿進(jìn)行一系列脫水，石蠟包埋用切片機(jī)切成6μM矢狀斷面。

 

組織學(xué)分析：視網(wǎng)膜切片脫蠟和蘇木精-伊紅染色（HE）。在三個(gè)不同的位置對(duì)外核層（ONL）厚度和單位面積細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行量化。中央（100-150μM距視神經(jīng)），外周（100-150μM距鋸齒緣）和中周（在中樞和外周之間）。每只眼睛隨機(jī)選擇兩個(gè)有代表性的部分，進(jìn)行測(cè)量和算平均值。僅對(duì)視神經(jīng)盤的視網(wǎng)膜部分進(jìn)行分析，不脫落的地區(qū)被排除在外。

 

TUNEL法：TUNEL法根據(jù)說明書對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行量化。每只眼睛隨機(jī)選擇兩個(gè)有代表性的部分。同樣，視網(wǎng)膜切片選擇顯示視神經(jīng)盤部分。在400倍放大倍率下每一個(gè)視網(wǎng)膜十四個(gè)區(qū)域被拍到，幾乎覆蓋了整個(gè)視網(wǎng)膜的長(zhǎng)度。切片用DAPI復(fù)染，核染色。外核層（ONL）細(xì)胞通過TUNEL和DAPI染色計(jì)算細(xì)胞凋亡數(shù)目。每只眼睛細(xì)胞凋亡率（TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)÷總ONL區(qū)域）。因?yàn)樗驯蛔C明的最大凋亡發(fā)生在視網(wǎng)膜脫離后3天，TUNEL染色僅在試驗(yàn)1和3執(zhí)行。

 

免疫組織化學(xué)：每只眼睛隨機(jī)選擇三個(gè)顯示視神經(jīng)盤的視網(wǎng)膜部分。脫蠟視網(wǎng)膜切片浸入抗原修復(fù)蛋白酶K溶液和10%山羊血清封閉一小時(shí)。然后在4°C同主要抗體孵育過夜：兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白，小鼠抗谷氨酰胺合成酶和兔抗視紫紅質(zhì)蛋白。經(jīng)PBS徹底清洗，放在相應(yīng)的二抗，室溫下1 h后孵育， DAPI復(fù)染，再次清洗，熒光顯微鏡下觀察。對(duì)視網(wǎng)膜切片進(jìn)行分級(jí)，從1到5，視紫紅質(zhì)GFAP免疫反應(yīng)強(qiáng)度，5是最強(qiáng)的。

 

Western blot分析：為劃定葉黃素發(fā)揮其抗凋亡作用的機(jī)理途徑，免疫印跡法對(duì)細(xì)胞凋亡過程中幾個(gè)關(guān)鍵參與者進(jìn)行分析。先觀察激活的caspase-3的活性，在細(xì)胞凋亡的最后共同通路中的重要感受器。進(jìn)一步研究葉黃素參與Fas介導(dǎo)的外在途徑和線粒體內(nèi)途徑激活的caspase-8和caspase-9的活性。實(shí)驗(yàn)1和3重復(fù)進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品的免疫印跡法。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組視網(wǎng)膜從玻璃體和視網(wǎng)膜色素上皮剝離，隨后在150 ml RIPA裂解緩沖液勻漿。實(shí)驗(yàn)眼，附加的視網(wǎng)膜部分手動(dòng)剝離。樣品于4°C， 13500 rpm離心25分鐘，吸取上清液。用分光光度計(jì)測(cè)定每一個(gè)樣品的蛋白質(zhì)濃度。用15%的SDS-PAGE凝膠對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜。含5%脫脂牛奶TBST進(jìn)行阻斷。膜同抗激活型caspase-3 、激活型caspase-8 , 激活型caspase-9、Bcl-2、磷酸化Akt的一抗在4°C孵育過夜。膜也與抗肌動(dòng)蛋白抗體室溫條件下孵育30分鐘。對(duì)蛋白條帶進(jìn)行檢測(cè)。

 

結(jié)果：視網(wǎng)膜脫落模型：所有脫落的視網(wǎng)膜保持脫落直到安樂死。脫落的百分比（約70%）是通過眼底照片記錄的。實(shí)驗(yàn)使用的動(dòng)物數(shù)目見表。術(shù)后并發(fā)癥包括輕微的出血，與注射和眼壓短暫升高有關(guān)。

 

ONL細(xì)胞凋亡：TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)僅存在于視網(wǎng)膜脫離的部位，通過使用感光細(xì)胞核DAPI染色共定位加以確認(rèn)。實(shí)驗(yàn)1中，葉黃素治療明顯減少細(xì)胞凋亡的數(shù)目，同賦形劑組相比。在實(shí)驗(yàn)3中得到了類似的結(jié)果，當(dāng)視網(wǎng)膜脫落后36h開始治療時(shí)。在實(shí)驗(yàn)2中，發(fā)現(xiàn)葉黃素處理組ONL保留的細(xì)胞比賦形劑組明顯多。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，對(duì)側(cè)未分開的視網(wǎng)膜大約每平方毫米有65304±1843個(gè)細(xì)胞。葉黃素治療眼剝離的視網(wǎng)膜大約每平方毫米有58202±1054個(gè)細(xì)胞。賦形劑治療眼剝離的視網(wǎng)膜大約每平方毫米有49843±1195個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)4 RD后36小時(shí)治療也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果，在ONL葉黃素處理的動(dòng)物也表現(xiàn)出更明顯的細(xì)胞存活。

 

視紫紅質(zhì)：實(shí)驗(yàn)1和3，無論4小時(shí)或36小時(shí)，葉黃素治療在厚度和強(qiáng)度方面與對(duì)照組相比導(dǎo)致相對(duì)保守的視紫紅質(zhì)（Rho）免疫反應(yīng)。同樣，從實(shí)驗(yàn)2和4的結(jié)果顯示了類似的趨勢(shì)，在實(shí)驗(yàn)4中，由于大的方差無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

 

GFAP：GFAP免疫反應(yīng)主要存在于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層（GCL）具有不同程度的擴(kuò)展到外層視網(wǎng)膜，說明Muller細(xì)胞增殖的過程。我們的研究結(jié)果表明，在RD后前3天，葉黃素或玉米油治療對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化方面沒有產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性差異。然而，在實(shí)驗(yàn)2和實(shí)驗(yàn)4，葉黃素治療顯著降低GFAP免疫反應(yīng)。Muller細(xì)胞長(zhǎng)度和厚度在賦形劑組比葉黃素治療組顯著增大，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞肥大和增殖。

 

凋亡通路：RD后36h治療組，激活型caspase-3蛋白水平明顯低于對(duì)照組。治療組在RD后4 h表現(xiàn)出相似的結(jié)果，雖然減少的趨勢(shì)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RD后4h 葉黃素治療組和賦形劑組caspase-8水平存在顯著性差異。RD后36 h接受治療有相似的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討論：抗凋亡作用：細(xì)胞凋亡是由多種細(xì)胞信號(hào)調(diào)制，其中半胱天冬酶構(gòu)成的核心作用。兩個(gè)主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的Fas介導(dǎo)線粒體外在和內(nèi)在途徑，最終匯聚形成最終的共同效應(yīng)途徑涉及半胱氨酸蛋白酶3，6和7。這兩種途徑都參與了RD后感光細(xì)胞凋亡。RD感光細(xì)胞凋亡的過程，程序性壞死、自噬與炎癥過程。

 

Muller細(xì)胞的活化和增殖：GFAP，膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生的一個(gè)標(biāo)志。RD誘導(dǎo)缺血導(dǎo)致Muller細(xì)胞的活化。Muller細(xì)胞過量可導(dǎo)致明顯的有害后果如黃斑前膜形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變（PVR）和視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕。進(jìn)一步減少剩余的感光細(xì)胞的數(shù)量和完整性，并一直外段再生。

 

外段的作用：視紫紅質(zhì)，眼睛中的一種天然色素，并作為視網(wǎng)膜功能的一個(gè)標(biāo)記。它是外段長(zhǎng)度和功能的一個(gè)敏感指標(biāo)。對(duì)外段恢復(fù)有影響。

 

結(jié)論：這是一種安全、方便、系統(tǒng)的治療方法并對(duì)缺血/再灌注模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)作用。我們使用透明質(zhì)酸鈉誘導(dǎo)視網(wǎng)膜脫落模型，葉黃素可以補(bǔ)救RD大鼠的感光細(xì)胞。