哺乳動物體外受精的過程包括卵母細胞的收集和體外成熟、精子的采集和體外獲能、體外受精、受精卵的體外培養(yǎng)和胚胎移植等步驟。
( 一 ) 卵母細胞的收集
小動物(如小鼠、大鼠等): 一般采取經(jīng)超數(shù)排卵處理后,處死動物,然后從輸卵管壺腰部收集卵母細胞。
較大動物(如兔、豬等): 一般用手術(shù)的方法從輸卵管內(nèi)、或從離體的卵巢中收集卵母細胞。從離體的卵巢收集的方法有卵泡抽吸法和卵巢解剖法這兩種方法。
卵泡抽吸法 : 用注射器的針頭插入卵巢表面的卵泡抽吸卵母細胞;
卵巢解剖法 : 用手術(shù)刀將卵巢切成兩半,去掉中間的髓質(zhì)部分,露出卵泡,劃破卵泡,在培養(yǎng)液中反復(fù)沖洗,采集其中的卵母細胞
( 二 ) 卵母細胞的體外成熟
卵泡中的卵母細胞尚未成熟,采集之后要通過體外的培養(yǎng),使其成熟,才有受精能力。這過程稱為卵母細胞的體外成熟(in vitro maturation,IVM)。用于卵母細胞的體外成熟的基礎(chǔ)養(yǎng)液主要有:BMOC-3、TYH、TCM199、Ham,sF-10、Menezo,B2、NUSC23和MEM等。在上述的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入血清5%～10% 、促性腺激素(0.1-1.OIU/ml HMG,0.1～1.0µg/ml HMG,0.1～1.0/ml LH 等)和生長因子(0.01～10µg/m1 EGF等 )等成分。
培養(yǎng)時間因動物不同而有所差別,一般為22～24h,但豬需培養(yǎng)40～44h, 而兔僅需 12～15h。
培養(yǎng)條件一般溫度為37～38℃,氣相為5%的C02。