細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中容易受到支原體的污染，往往對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生非常不好的影響，發(fā)現(xiàn)的早則耽誤些功夫重新培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)的晚可能一段時(shí)間內(nèi)的實(shí)驗(yàn)都白做了，那么如何通過(guò)不同的檢測(cè)方法檢測(cè)到支原體的蹤跡？

　　支原體是非常微小的微生物，其直徑只有0.2-0.8µm，是細(xì)胞培養(yǎng)中令人頭疼的大問(wèn)題。關(guān)鍵是其污染源簡(jiǎn)直來(lái)自四面八方：

• 培養(yǎng)基

• 血清

• 實(shí)驗(yàn)操作者

• ．．．

會(huì)影響：

• 細(xì)胞生長(zhǎng)率

• 細(xì)胞形態(tài)

• 基因表達(dá)

• 細(xì)胞代謝和細(xì)胞活力。

　　支原體感染不易察覺(jué)，因此對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞定期進(jìn)行支原體檢測(cè)就非常重要。

　　污染實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)細(xì)胞的支原體主要有八種，但還沒(méi)有哪種檢測(cè)方法能夠單槍匹馬把這八種支原體都檢測(cè)出來(lái)。支原體非常頑強(qiáng)，通常用于細(xì)胞培養(yǎng)的絕大多數(shù)抗生素都對(duì)其無(wú)效。例如青霉素主要作用于細(xì)菌細(xì)胞壁，但支原體沒(méi)有細(xì)胞壁因此就不受影響。

　　無(wú)懈可擊的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)始終是預(yù)防支原體感染的最佳方式，另外及時(shí)找出受到支原體感染的培養(yǎng)物也很重要，這樣才能在感染擴(kuò)散前快速采取有效措施。刀王就為你介紹幾種在培養(yǎng)細(xì)胞中檢測(cè)支原體的常用方法。

分離培養(yǎng)法

　　分離培養(yǎng)法是支原體檢測(cè)的金標(biāo)方法，其檢測(cè)精確度最高。這種方法是從可疑的細(xì)胞培養(yǎng)體系中取樣，并接種到最適宜支原體生長(zhǎng)的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會(huì)在這種瓊脂平板上瘋狂生長(zhǎng)，最終形成明顯可見(jiàn)的特征性菌落。分離培養(yǎng)法基本不會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，因此被譽(yù)為支原體檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。

　　不過(guò)分離培養(yǎng)法也存在兩個(gè)弊端：

　　一是檢測(cè)時(shí)間太長(zhǎng)，支原體要長(zhǎng)出明顯克隆至少需要4周時(shí)間；

　　二是盡管可以檢測(cè)絕大多數(shù)支原體種類(lèi)，分離培養(yǎng)法也有力所不及的時(shí)候，例如支原體M.hyorhinis。

　　如果你實(shí)在不想等這么久，或者希望在分離培養(yǎng)法的等待過(guò)程中先拿到初步結(jié)果，你可以試一試DNA、PCR或酶學(xué)檢測(cè)方法。不過(guò)需要注意的是，上述檢測(cè)方法都不能單獨(dú)檢出所有類(lèi)型的支原體，而且靈敏度也沒(méi)有分離培養(yǎng)法高，所以最好結(jié)合使用兩種方法以獲得最可靠的檢測(cè)結(jié)果。

DNA檢測(cè)

　　DNA檢測(cè)需要將可疑樣品與指示細(xì)胞共同培養(yǎng)，因此一般需要幾天時(shí)間。DNA檢測(cè)所用的指示細(xì)胞通常是細(xì)胞質(zhì)區(qū)域較大的Vero細(xì)胞，如果原樣本中含有支原體，那么當(dāng)細(xì)胞DNA被熒光染料（如Hoechst染料）染色時(shí)，就可以在指示細(xì)胞的核周?chē)^察到熒光斑點(diǎn)或熒光顆粒。分離培養(yǎng)法用來(lái)檢測(cè)支原體M.hyorhinis菌株并不可靠，而DNA法可以準(zhǔn)確的將其檢測(cè)出來(lái)。

PCR法

　　PCR法也可以檢測(cè)M.hyorhinis菌株，PCR法檢測(cè)支原體只需幾個(gè)小時(shí)，是最快但也是最不靈敏的支原體檢測(cè)方法。該方法采用針對(duì)支原體DNA的引物用PCR檢測(cè)可疑樣本，其中PCR引物通常針對(duì)支原體的16S rRNA基因。在凝膠電泳過(guò)程中，支原體DNA會(huì)顯示為特異性條帶，以此指示支原體的存在。PCR法可以檢測(cè)大多數(shù)支原體，但謹(jǐn)慎起見(jiàn)最好同時(shí)使用另一種檢測(cè)方法來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。

酶學(xué)檢測(cè)和ELISA

　　此外，也還存在一些其他支原體檢測(cè)方法。例如酶學(xué)檢測(cè)是將可疑樣本添加到特定底物中，在這一體系內(nèi)支原體的酶可以將ADP轉(zhuǎn)化為ATP，隨后能利用ATP發(fā)光的luciferase酶就可以指示支原體的存在。ELISA也能用于支原體檢測(cè)，以ELISA法為基礎(chǔ)的支原體檢測(cè)一般使用針對(duì)支原體16S rRNA基因的帶標(biāo)記探針或抗體，來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)物中是否含有支原體。

定期檢測(cè)

　　支原體感染會(huì)使培養(yǎng)細(xì)胞慢慢枯萎，因此對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞定期進(jìn)行支原體檢測(cè)非常重要。一般來(lái)說(shuō)每1至3個(gè)月就應(yīng)該進(jìn)行一次支原體檢測(cè)。將定期支原體檢測(cè)常規(guī)化堅(jiān)持下去，是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)支原體感染的關(guān)鍵。

預(yù)防支原體污染的建議：

細(xì)胞培養(yǎng)工作中，主要從以下幾個(gè)方面來(lái)預(yù)防支原體的污染：

• 控制環(huán)境污染;

• 嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作;

• 細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保證無(wú)菌;

• 在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。

　　支原體污染細(xì)胞后，特別是重要的細(xì)胞株，有必要清除支原體，常用方法有

• 抗生素處理

• 抗血清處理

• 抗生素加抗血清和補(bǔ)體聯(lián)合處理

　　支原體最突出的結(jié)構(gòu)特征是沒(méi)有細(xì)胞壁，一般來(lái)講，對(duì)作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素，如內(nèi)酰胺類(lèi)、萬(wàn)古霉素等完全不敏感;對(duì)多粘菌素(polymycin)、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對(duì)支原體最有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)及一些氟喹諾酮;其他類(lèi)抗生素如氨基糖苷類(lèi)、氯霉素對(duì)支原體有較小抑制作用，所以常不用來(lái)作為支原體感染的化學(xué)治療劑。InvivoGen公司研究開(kāi)發(fā)的新一代支原體抗生素M-Plasmocin能有效地殺滅支原體，不影響細(xì)胞本身的代謝，并且用M-Plasmocin處理過(guò)的培養(yǎng)細(xì)胞，不會(huì)重新感染支原體。

　　支原體污染在細(xì)胞培養(yǎng)中實(shí)際上是比較常見(jiàn)的， 據(jù)資料，可達(dá)30%甚至更高。支原體污染時(shí)細(xì)胞表現(xiàn)為長(zhǎng)得不好，也不死亡，同時(shí)，培養(yǎng)基又是清亮的。時(shí)間長(zhǎng)達(dá)一周也沒(méi)有什么變化。這時(shí)基本上可以判斷出是支原體污染了，愿意檢測(cè)就檢測(cè)一下，不愿意直接用清除試劑處理吧。

　　避免細(xì)胞污染，可以從預(yù)防著手，超凈工作臺(tái)物品放置要合理、進(jìn)入細(xì)胞房要換鞋和穿實(shí)驗(yàn)服、實(shí)驗(yàn)員戴手套后要用酒精等消毒、避免細(xì)胞交叉污染等等。