導(dǎo)讀

        冷凍保護(hù)劑是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。冷凍保護(hù)劑常常配制成一定的溶液。一般來講，只有紅細(xì)胞、大多數(shù)微生物和極少數(shù)有核的哺乳動物細(xì)胞懸浮在不加冷凍保護(hù)劑的水或簡單的鹽溶液中，并以最適的冷凍速率冷凍，可以獲得活的凍存物。

        但對于大多數(shù)有核哺乳動物細(xì)胞來說，在不加冷凍保護(hù)劑的情況下，無最適冷凍速率可言，也不能獲得活的冷凍物。例如將小鼠骨髓細(xì)胞懸浮在不加冷凍保護(hù)劑的平衡鹽溶液中，并以0.3～600℃/min 的冷凍速率降溫冷凍，98% 以上的細(xì)胞會死亡；而加入甘油冷凍保護(hù)劑進(jìn)行冷凍保存時，98% 以上的細(xì)胞都可存活。

冷凍保護(hù)劑可分為滲透性和非滲透性兩類。

01 class 滲透性冷凍保護(hù)劑

        滲透性冷凍保護(hù)劑可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是一些小分子物質(zhì)，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保護(hù)機(jī)制是在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷，同時，細(xì)胞內(nèi)水分也不會過分外滲，避免了細(xì)胞過分脫水皺縮。

        甘油和DMSO并不防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰，在使用該類冷凍保護(hù)劑時，需要一定的時間進(jìn)行預(yù)冷，讓甘油或DMSO等成分滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡以起到充分的保護(hù)作用。

        目前DMSO的應(yīng)用比甘油更為廣泛，但要注意的是，DMSO在常溫下對細(xì)胞的毒性作用較大，而在4℃時，其毒性作用大大減弱，且仍能以較快的速度滲透到細(xì)胞內(nèi)。所以，凍存時DMSO平衡多在4℃下進(jìn)行，一般需要40～60分鐘。

02 class 非滲透性冷凍保護(hù)劑

        非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等。其保護(hù)機(jī)制的假說很多，其中有一種可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中水分子結(jié)合，降低溶液中自由水的含量，使冰點降低，減少冰晶的形成；同時，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷。

結(jié)語

        不同的冷凍保護(hù)劑有不同的優(yōu)、缺點。目前一般多采用聯(lián)合使用兩種以上冷凍保護(hù)劑組成保護(hù)液。由于許多冷凍保護(hù)劑（如 DMSO）在低溫下能保護(hù)細(xì)胞，但在常溫下卻對細(xì)胞有害，故在細(xì)胞復(fù)溫后應(yīng)及時洗滌冷凍保護(hù)劑。