上回說到如何進(jìn)行蛋白質(zhì)的樣品制備、蛋白質(zhì)定量及 SDS－PAGE 電泳，如果你還沒看過，點此詳見：《獻(xiàn)給初學(xué)者：western blot 操作步驟詳解（上） 》。下面就跟大家講講接下來的步驟。
四、轉(zhuǎn)膜
我們實驗室使用的是半干轉(zhuǎn)膜電泳槽。對于轉(zhuǎn)印 90 kd 以下的蛋白，轉(zhuǎn)膜液都不用加 SDS,如果是蛋白分子量大的話可以加入 0.037% 的 SDS。
在電泳結(jié)束前 20 min 開始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜所需的東西。轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備 6 張的濾紙（長一般為 8.1~8.3 cm，寬度根據(jù)裁的膠大小實際測量，但膠一般會縮水，所以裁 8 cm 就行）和 1 張 PVDF 膜。切濾紙和膜時一定要戴干凈手套，因為手上的蛋白會污染膜。PVDF 膜使用前用無水甲醇中浸泡 1 min~2 min。目的是為了活化 PVDF 膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。
將玻璃板撬開才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板（撬時一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附帶的塑料除霜鏟，效果出奇的好）。除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去，要避免把分離膠刮破。也可取 10 ml 注射器吸滿轉(zhuǎn)印緩沖液，往玻璃板與凝膠之間注水，使液體的壓力將兩者自然分開。
取出凝膠后應(yīng)注意分清上下，可以在右上角裁一個小角。之后有兩種方法供選擇，一是按照 marker 指示，把含有自己感興趣的蛋白的膠裁下來，二是把整張膠轉(zhuǎn)膜，前一種方法更加節(jié)約材料，但操作稍微麻煩了一點。在加有轉(zhuǎn)移液的培養(yǎng)皿里放入裁好的膠、浸過甲醇的 PVDF 膜和濾紙，平衡 10 min 左右，也是為了除去濾紙和轉(zhuǎn)移膜中的氣泡以及膠上多余的 SDS。
帶上手套，平放轉(zhuǎn)移槽的底座，依次在石墨電極上疊放 3 張浸泡過緩沖液的濾紙、PVDF 膜（此時可在 PVDF 右上角減去一個角，以辨明轉(zhuǎn)膜后的蛋白面與非蛋白面）、剛剛完成電泳的凝膠和另外 3 張浸泡過緩沖液的濾紙。用槍頭或移液管在疊層的濾紙上滾動，除去氣泡。注意每疊一層就要用玻璃棒或圓筒試管趕去氣泡，因為一個氣泡的厚度對于蛋白來說都是十萬八千里的。
用干凈紗布將疊層上面和周圍的多余緩沖液吸干（這一步很重要，寧可太干也不能太濕，太干容易燒胡，太濕的話多余的緩沖液會導(dǎo)致電流短路，大大降低轉(zhuǎn)移效率，如果同時轉(zhuǎn)好幾條膠的時候更要小心，有一個膠短路就會影響整體的轉(zhuǎn)移效率）。最后將轉(zhuǎn)移槽的上蓋扣上，接通電源開始轉(zhuǎn)膜。
由于設(shè)備昂貴，第一次操作應(yīng)向熟手請教，否則短路可能燒壞設(shè)備！轉(zhuǎn)完后立即清洗設(shè)備，特別是金屬上蓋，轉(zhuǎn)膜液特別容易在金屬上蓋上形成結(jié)痂，影響設(shè)備的正常使用，我們實驗室今年做 western 的同志因為忽略這一點，轉(zhuǎn)膜儀燒壞了好幾次。
依據(jù)分子量大小電泳 15~60 min。如果初次轉(zhuǎn)膜，可以根據(jù)一般經(jīng)驗，即多少 kD 的蛋白就轉(zhuǎn)多少分鐘，再根據(jù)結(jié)果調(diào)整時間。之后斷開電源，取出轉(zhuǎn)移膜進(jìn)行后繼實驗。
為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預(yù)染。傳統(tǒng)方法是將膜用 1×麗春紅染液染 5 min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。實際上更常用且簡便的方法是先將膜晾干，然后浸入 20% 的甲醇，待完全浸濕后取出透光觀察即可看到蛋白條帶（此方法僅僅適合 PVDF 膜）。將膜晾干備用。使用預(yù)染 marker 話可以看見 marker 的顏色轉(zhuǎn)印到了膜上，但是憑借這個顏色來判斷是否轉(zhuǎn)印完全或轉(zhuǎn)印過頭是不可靠的。
五、免疫雜交反應(yīng)
將膜移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉 1 h 即可。如果是自己配置的封閉液，最好過濾一下以消除固體雜質(zhì)。實際經(jīng)驗表明與其封閉過夜，不如一抗孵育過夜。
將一抗用封閉液稀釋（一般用封閉液稀釋即可，如果背景不高用 TBST 稀釋也可以，當(dāng)然熟練后還可以自由發(fā)揮，配制一些自己的復(fù)方稀釋液）至適當(dāng)濃度（可以在 1.5 mlEP 管中配置工作液，常用稀釋倍數(shù)為 1:200，1:500，1:1 000，具體需要預(yù)實驗進(jìn)行摸索，用后可回收重復(fù)用 2~3 次，但回收重復(fù)利用的效果如何就要看抗體的質(zhì)量，分裝的抗體不推薦回收。稀釋后應(yīng)在 2-3 天內(nèi)使用，4 度保存，避免反復(fù)凍融。）
撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實驗臺面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡（也可使用手術(shù)室的病理袋，質(zhì)量不錯，減去下面的折疊部分，用封口器（40~80 元一個）封上，不漏液即可）。37° 孵育 1 h 之后轉(zhuǎn)移到室溫下再孵育 1 h（或者 4°孵育過夜），用 TBST 在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次 10 min；再用 TBS 洗一次，10 min。也可以多洗幾次，比如 4 次，每次 5 min。
在培養(yǎng)皿內(nèi)加入二抗稀釋液（10 ml 足夠了，一般 1:1 000 甚至 1:10 000 用 TBST 稀釋），放在搖床上，室溫下孵育 1~2 h 后，用 TBST 在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次 10 min；再用 TBS 洗一次，10 min,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。選擇好一個合適的條件不要輕易改變，另外相比一抗，二抗作用的時間應(yīng)嚴(yán)格控制，實踐證明一抗時間長點可能沒什么關(guān)系，而二抗時間若過長過短都將會直接影響結(jié)果。二抗孵育之后還要注意好好洗滌，否則顯影是背景可能臟。
六、化學(xué)發(fā)光（ECL），顯影，定影
現(xiàn)在工作臺上鋪一張保鮮膜，將 PVDF 膜放在保鮮膜上。將 ECL 的 A 和 B 兩種試劑在 EP 管內(nèi)等體積混合（注意吸完 A 試劑后吸 B 試劑前要患槍頭），然后均勻滴在 PVDF 膜的蛋白面，反應(yīng) 1~2 min 后，將 PVDF 膜上多余的 ECL 工作液吸干，之后轉(zhuǎn)移到在 X 片夾中預(yù)先鋪好的保鮮膜上一側(cè)，把另一側(cè)翻過來蓋在其上。用透明膠把保鮮膜固定在片夾上。
在暗室中，將 1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出 X-光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L和寬均需大 1 cm）；打開 X-光片夾，把 X-光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關(guān)上 X-光片夾，開始計時；根據(jù)信號的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時間，一般為 1 min 到 2 min，也可選擇不同時間多次壓片，以達(dá)最佳效果（也有人重疊壓好幾張片，固定曝光 5~10 分鐘，從這好幾張片中選出最合適的底片）；曝光完成后，打開 X-光片夾，取出 X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。
顯影時間一般為 1~2 min（20~25℃），溫度過低時（低于 16℃）需適當(dāng)延長顯影時間；顯影結(jié)束后，馬上把 X-光片浸入定影液中，定影時間一般為 5~10 min,以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干（注意：顯影和定影需移動膠片時，盡量拿膠片一角，手指甲不要劃傷膠片，否則會對結(jié)果產(chǎn)生影響）。
X 光片一般選用柯達(dá)原裝的生物實驗專用柯達(dá) X-OMATBT 膠片 .顯影液和定影液最好每周配置一次，避光室溫保存，顯影和定影液是最便宜的試劑了，千萬不要因為它而影響了整個結(jié)果。
七、凝膠圖象分析
將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值，比如 bio-rad 的 Quantity One。如何使用敬請關(guān)注我們下一期內(nèi)容。
主要參考資料
WB 實戰(zhàn)指南+正確使用 Quantity One定量 by jacqueslm2001
Abcam 的 western 新手指南
土豆網(wǎng)的 western blot 視頻 上海交大出品
《分子克隆實驗指南》精編版 化學(xué)工業(yè)出版社
《抗體技術(shù)實驗指南》科學(xué)技術(shù)出版社
milipore 的 western blot 的優(yōu)化方案
Western blot 步步看--網(wǎng)絡(luò)流傳最廣的資料，作者不詳
Bio-rad 蛋白印跡手冊
窮人的勞斯萊斯-我的五年western blot體會
附：Western Blot Quick Guide 以及一天跑完 Western 的時間規(guī)劃
前期準(zhǔn)備：蛋白已經(jīng)定量，各樣本已經(jīng)稀釋到某固定濃度，已經(jīng)和 SDS loading buffer 混合，已經(jīng)分裝好，保存與 -20°。頭天下午或晚上配膠，分離膠和濃縮膠一起配好，帶上梳子，放入潮濕的自封袋內(nèi)放入 4° 冰箱備用。
8:00 從冰箱里取出蛋白樣品，用 PCR 儀 95 度加熱 5 min?；旌暇鶆虿㈦x心。
8:30 取出昨晚配好的膠，組合，加電泳液。在電泳液里拔梳子能稍微容易一些。用 10 uL的槍加樣。
9:00 開始電泳。恒流 30 mA 一般 1 個小時足夠了。
9:30 開始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜用的濾紙和 PVDF 膜，PVDF 膜泡甲醇。一般 8 cm 的寬是固定的，所以如果要裁膠的話可以先大概估計一下。
10:10 電泳結(jié)束（假設(shè)電泳用了 70 min），起開玻璃板，裁出膠上所要的條帶，如果整塊膠轉(zhuǎn)就更方便了。把膠放在盛有轉(zhuǎn)膜緩沖液的培養(yǎng)皿里。
11:00 轉(zhuǎn)膜開始（這里裁紙和鋪三明治還是比較費(fèi)時間的，我一般要用 30 ~ 50 min，所以這里要抓緊時間）。
12:00 轉(zhuǎn)膜結(jié)束（這里按 60 min 的半干轉(zhuǎn)的時間來計算）。開始封閉 1 h。
13:00 封閉結(jié)束，開始孵育一抗（在這里你可以選擇一抗孵育過夜，如果不過夜的那一天就能結(jié)束），如果不過夜的話我一般選擇 37° 1 h 然后在室溫（23°左右）再1h。
15:00 一抗孵育結(jié)束。TBST洗滌 3*10 min或者 5*6 min。
15:30 開始孵育二抗。室溫 1 h 足夠了。
16:30 二抗孵育結(jié)束。TBST 洗滌 3*10 min或者 5*6 min，這里推薦采用 5*6 min。
17:00 ECL 發(fā)光，壓片 10 min，顯影 1 min，定影 10 min，那么在 18:00之前你就能看到結(jié)果。如果結(jié)果不好還有后招，用 stripping（一抗二抗洗脫液）洗滌，我用的是碧云天的堿性一抗二抗洗脫液，按照說明書來一般 20 min 就行，然后洗滌幾次，重新封閉 1 h，然后一抗過夜，明日再繼續(xù)戰(zhàn)斗。這樣的話 18:30 之前也能結(jié)束戰(zhàn)斗。
