亚洲精品宾馆在线精品酒店,久久久精品久久久欧美俄罗乱妇,给我播放片高清MV在线观看,边摸边脱吃奶边高潮视频免费

logo

獻(xiàn)給初學(xué)者:western blot 操作步驟詳解(下)

來源:群英醫(yī)學(xué)發(fā)布時間:2017-04-14 11:15:54

        上回說到如何進(jìn)行蛋白質(zhì)的樣品制備、蛋白質(zhì)定量及 SDS-PAGE 電泳,如果你還沒看過,點此詳見:《獻(xiàn)給初學(xué)者:western blot 操作步驟詳解(上) 》。下面就跟大家講講接下來的步驟。
四、轉(zhuǎn)膜
        我們實驗室使用的是半干轉(zhuǎn)膜電泳槽。對于轉(zhuǎn)印 90 kd 以下的蛋白,轉(zhuǎn)膜液都不用加 SDS,如果是蛋白分子量大的話可以加入 0.037% 的 SDS。
        在電泳結(jié)束前 20 min 開始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜所需的東西。轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備 6 張的濾紙(長一般為 8.1~8.3 cm,寬度根據(jù)裁的膠大小實際測量,但膠一般會縮水,所以裁 8 cm 就行)和 1 張 PVDF 膜。切濾紙和膜時一定要戴干凈手套,因為手上的蛋白會污染膜。PVDF 膜使用前用無水甲醇中浸泡 1 min~2 min。目的是為了活化 PVDF 膜上面的正電基團(tuán),使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合,做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。
        將玻璃板撬開才可剝膠,撬的時候動作要輕,要在兩個邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會兒玻璃板便開始松動,直到撬去玻板(撬時一定要小心,玻板很脆弱,我用的是冰箱里附帶的塑料除霜鏟,效果出奇的好)。除去小玻璃板后,將濃縮膠輕輕刮去,要避免把分離膠刮破。也可取 10 ml 注射器吸滿轉(zhuǎn)印緩沖液,往玻璃板與凝膠之間注水,使液體的壓力將兩者自然分開。
        取出凝膠后應(yīng)注意分清上下,可以在右上角裁一個小角。之后有兩種方法供選擇,一是按照 marker 指示,把含有自己感興趣的蛋白的膠裁下來,二是把整張膠轉(zhuǎn)膜,前一種方法更加節(jié)約材料,但操作稍微麻煩了一點。在加有轉(zhuǎn)移液的培養(yǎng)皿里放入裁好的膠、浸過甲醇的 PVDF 膜和濾紙,平衡 10 min 左右,也是為了除去濾紙和轉(zhuǎn)移膜中的氣泡以及膠上多余的 SDS。
        帶上手套,平放轉(zhuǎn)移槽的底座,依次在石墨電極上疊放 3 張浸泡過緩沖液的濾紙、PVDF 膜(此時可在 PVDF 右上角減去一個角,以辨明轉(zhuǎn)膜后的蛋白面與非蛋白面)、剛剛完成電泳的凝膠和另外 3 張浸泡過緩沖液的濾紙。用槍頭或移液管在疊層的濾紙上滾動,除去氣泡。注意每疊一層就要用玻璃棒或圓筒試管趕去氣泡,因為一個氣泡的厚度對于蛋白來說都是十萬八千里的。
        用干凈紗布將疊層上面和周圍的多余緩沖液吸干(這一步很重要,寧可太干也不能太濕,太干容易燒胡,太濕的話多余的緩沖液會導(dǎo)致電流短路,大大降低轉(zhuǎn)移效率,如果同時轉(zhuǎn)好幾條膠的時候更要小心,有一個膠短路就會影響整體的轉(zhuǎn)移效率)。最后將轉(zhuǎn)移槽的上蓋扣上,接通電源開始轉(zhuǎn)膜。
        由于設(shè)備昂貴,第一次操作應(yīng)向熟手請教,否則短路可能燒壞設(shè)備!轉(zhuǎn)完后立即清洗設(shè)備,特別是金屬上蓋,轉(zhuǎn)膜液特別容易在金屬上蓋上形成結(jié)痂,影響設(shè)備的正常使用,我們實驗室今年做 western 的同志因為忽略這一點,轉(zhuǎn)膜儀燒壞了好幾次。
        依據(jù)分子量大小電泳 15~60 min。如果初次轉(zhuǎn)膜,可以根據(jù)一般經(jīng)驗,即多少 kD 的蛋白就轉(zhuǎn)多少分鐘,再根據(jù)結(jié)果調(diào)整時間。之后斷開電源,取出轉(zhuǎn)移膜進(jìn)行后繼實驗。
        為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果,以及判斷蛋白分子量大小,最好使用預(yù)染。傳統(tǒng)方法是將膜用 1×麗春紅染液染 5 min(于脫色搖床上搖)。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。實際上更常用且簡便的方法是先將膜晾干,然后浸入 20% 的甲醇,待完全浸濕后取出透光觀察即可看到蛋白條帶(此方法僅僅適合 PVDF 膜)。將膜晾干備用。使用預(yù)染 marker 話可以看見 marker 的顏色轉(zhuǎn)印到了膜上,但是憑借這個顏色來判斷是否轉(zhuǎn)印完全或轉(zhuǎn)印過頭是不可靠的。
五、免疫雜交反應(yīng)
        將膜移至含有封閉液的平皿中,室溫下脫色搖床上搖動封閉 1 h 即可。如果是自己配置的封閉液,最好過濾一下以消除固體雜質(zhì)。實際經(jīng)驗表明與其封閉過夜,不如一抗孵育過夜。
        將一抗用封閉液稀釋(一般用封閉液稀釋即可,如果背景不高用 TBST 稀釋也可以,當(dāng)然熟練后還可以自由發(fā)揮,配制一些自己的復(fù)方稀釋液)至適當(dāng)濃度(可以在 1.5 mlEP 管中配置工作液,常用稀釋倍數(shù)為 1:200,1:500,1:1 000,具體需要預(yù)實驗進(jìn)行摸索,用后可回收重復(fù)用 2~3 次,但回收重復(fù)利用的效果如何就要看抗體的質(zhì)量,分裝的抗體不推薦回收。稀釋后應(yīng)在 2-3 天內(nèi)使用,4 度保存,避免反復(fù)凍融。)
        撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實驗臺面上,四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整;將抗體溶液加到保鮮膜上;從封閉液中取出膜,用濾紙吸去殘留液后,將膜蛋白面朝下放于抗體液面上,掀動膜四角以趕出殘留氣泡(也可使用手術(shù)室的病理袋,質(zhì)量不錯,減去下面的折疊部分,用封口器(40~80 元一個)封上,不漏液即可)。37° 孵育 1 h 之后轉(zhuǎn)移到室溫下再孵育 1 h(或者 4°孵育過夜),用 TBST 在室溫下脫色搖床上洗兩次,每次 10 min;再用 TBS 洗一次,10 min。也可以多洗幾次,比如 4 次,每次 5 min。
        在培養(yǎng)皿內(nèi)加入二抗稀釋液(10 ml 足夠了,一般 1:1 000 甚至 1:10 000 用 TBST 稀釋),放在搖床上,室溫下孵育 1~2 h 后,用 TBST 在室溫下脫色搖床上洗兩次,每次 10 min;再用 TBS 洗一次,10 min,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。選擇好一個合適的條件不要輕易改變,另外相比一抗,二抗作用的時間應(yīng)嚴(yán)格控制,實踐證明一抗時間長點可能沒什么關(guān)系,而二抗時間若過長過短都將會直接影響結(jié)果。二抗孵育之后還要注意好好洗滌,否則顯影是背景可能臟。
六、化學(xué)發(fā)光(ECL),顯影,定影
        現(xiàn)在工作臺上鋪一張保鮮膜,將 PVDF 膜放在保鮮膜上。將 ECL 的 A 和 B 兩種試劑在 EP 管內(nèi)等體積混合(注意吸完 A 試劑后吸 B 試劑前要患槍頭),然后均勻滴在 PVDF 膜的蛋白面,反應(yīng) 1~2 min 后,將 PVDF 膜上多余的 ECL 工作液吸干,之后轉(zhuǎn)移到在 X 片夾中預(yù)先鋪好的保鮮膜上一側(cè),把另一側(cè)翻過來蓋在其上。用透明膠把保鮮膜固定在片夾上。
        在暗室中,將 1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中;在紅燈下取出 X-光片,用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L和寬均需大 1 cm);打開 X-光片夾,把 X-光片放在膜上,一旦放上,便不能移動,關(guān)上 X-光片夾,開始計時;根據(jù)信號的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時間,一般為 1 min 到 2 min,也可選擇不同時間多次壓片,以達(dá)最佳效果(也有人重疊壓好幾張片,固定曝光 5~10 分鐘,從這好幾張片中選出最合適的底片);曝光完成后,打開 X-光片夾,取出 X-光片,迅速浸入顯影液中顯影,待出現(xiàn)明顯條帶后,即刻終止顯影。
        顯影時間一般為 1~2 min(20~25℃),溫度過低時(低于 16℃)需適當(dāng)延長顯影時間;顯影結(jié)束后,馬上把 X-光片浸入定影液中,定影時間一般為 5~10 min,以膠片透明為止;用自來水沖去殘留的定影液后,室溫下晾干(注意:顯影和定影需移動膠片時,盡量拿膠片一角,手指甲不要劃傷膠片,否則會對結(jié)果產(chǎn)生影響)。
        X 光片一般選用柯達(dá)原裝的生物實驗專用柯達(dá) X-OMATBT 膠片 .顯影液和定影液最好每周配置一次,避光室溫保存,顯影和定影液是最便宜的試劑了,千萬不要因為它而影響了整個結(jié)果。
七、凝膠圖象分析
        將膠片進(jìn)行掃描或拍照,用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值,比如 bio-rad 的 Quantity One。如何使用敬請關(guān)注我們下一期內(nèi)容。
主要參考資料
WB 實戰(zhàn)指南+正確使用 Quantity One定量 by jacqueslm2001
Abcam 的 western 新手指南
土豆網(wǎng)的 western blot 視頻 上海交大出品
《分子克隆實驗指南》精編版 化學(xué)工業(yè)出版社
《抗體技術(shù)實驗指南》科學(xué)技術(shù)出版社
milipore 的 western blot 的優(yōu)化方案
Western blot 步步看--網(wǎng)絡(luò)流傳最廣的資料,作者不詳
Bio-rad 蛋白印跡手冊
窮人的勞斯萊斯-我的五年western blot體會
附:Western Blot Quick Guide 以及一天跑完 Western 的時間規(guī)劃
前期準(zhǔn)備:蛋白已經(jīng)定量,各樣本已經(jīng)稀釋到某固定濃度,已經(jīng)和 SDS loading buffer 混合,已經(jīng)分裝好,保存與 -20°。頭天下午或晚上配膠,分離膠和濃縮膠一起配好,帶上梳子,放入潮濕的自封袋內(nèi)放入 4° 冰箱備用。
8:00 從冰箱里取出蛋白樣品,用 PCR 儀 95 度加熱 5 min?;旌暇鶆虿㈦x心。
8:30 取出昨晚配好的膠,組合,加電泳液。在電泳液里拔梳子能稍微容易一些。用 10 uL的槍加樣。
9:00 開始電泳。恒流 30 mA 一般 1 個小時足夠了。
9:30 開始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜用的濾紙和 PVDF 膜,PVDF 膜泡甲醇。一般 8 cm 的寬是固定的,所以如果要裁膠的話可以先大概估計一下。
10:10 電泳結(jié)束(假設(shè)電泳用了 70 min),起開玻璃板,裁出膠上所要的條帶,如果整塊膠轉(zhuǎn)就更方便了。把膠放在盛有轉(zhuǎn)膜緩沖液的培養(yǎng)皿里。
11:00 轉(zhuǎn)膜開始(這里裁紙和鋪三明治還是比較費(fèi)時間的,我一般要用 30 ~ 50 min,所以這里要抓緊時間)。
12:00 轉(zhuǎn)膜結(jié)束(這里按 60 min 的半干轉(zhuǎn)的時間來計算)。開始封閉 1 h。
13:00 封閉結(jié)束,開始孵育一抗(在這里你可以選擇一抗孵育過夜,如果不過夜的那一天就能結(jié)束),如果不過夜的話我一般選擇 37° 1 h 然后在室溫(23°左右)再1h。
15:00 一抗孵育結(jié)束。TBST洗滌 3*10 min或者 5*6 min。
15:30 開始孵育二抗。室溫 1 h 足夠了。
16:30 二抗孵育結(jié)束。TBST 洗滌 3*10 min或者 5*6 min,這里推薦采用 5*6 min。
17:00 ECL 發(fā)光,壓片 10 min,顯影 1 min,定影 10 min,那么在 18:00之前你就能看到結(jié)果。如果結(jié)果不好還有后招,用 stripping(一抗二抗洗脫液)洗滌,我用的是碧云天的堿性一抗二抗洗脫液,按照說明書來一般 20 min 就行,然后洗滌幾次,重新封閉 1 h,然后一抗過夜,明日再繼續(xù)戰(zhàn)斗。這樣的話 18:30 之前也能結(jié)束戰(zhàn)斗。