顯微注射法的基本原理和方法
轉(zhuǎn)基因小鼠制備的基本原理是將改建后的目的基因(或基因組片段)用顯微注射法注入供體小鼠的受精卵(或著床前胚胎細(xì)胞)，然后將此受精卵(或著床前胚胎細(xì)胞)再植入受體動(dòng)物的輸卵管(或子宮)中，使其發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，通過(guò)分析轉(zhuǎn)基因和實(shí)驗(yàn)小鼠表型的關(guān)系，研究揭示外源基因的功能，而且可進(jìn)行工程動(dòng)物的大量生產(chǎn)。
Gorden等報(bào)道了顯微注射法用于轉(zhuǎn)基因小鼠的制備。本法是最早，且應(yīng)用成功率較高的一種轉(zhuǎn)基因方法。其基本步驟如下：
1.同步獲得供體雌鼠（注射激素的雌鼠與正常雄鼠交配而得）和假孕受體母鼠（正常雌鼠與結(jié)扎雄鼠交配產(chǎn)生)。
2.供體鼠注射絨毛膜促性腺激素后，采集清晰的原核受精卵。
3.用顯微注射法將純化的外源基因注射進(jìn)受精卵的原核內(nèi)。
4.受精卵鑒定，將存活受精卵或存活胚胎移植到同步交配的假孕母鼠的輸卵管(或子宮)內(nèi)，飼養(yǎng)后鑒定是否受孕以及個(gè)體發(fā)育狀況。
5.子代鼠外源基因整合和表達(dá)的檢測(cè)。
6.轉(zhuǎn)基因小鼠品系的建立。
[優(yōu)點(diǎn)]
（1）外源基因在宿主染色體上的整合率相對(duì)較高；
（2）此法導(dǎo)入外源基因無(wú)需載體；
（3）轉(zhuǎn)基因小鼠得率在60%-80%；
（4）導(dǎo)入的外源基因可長(zhǎng)達(dá)50kb。
[不足之處]
（1）外源基因隨機(jī)整合；
（2）個(gè)別原核不清晰，需進(jìn)行特殊處理；
（3）需大型精密儀器，費(fèi)用昂貴；
（4）操作周期相對(duì)較長(zhǎng)。
實(shí)驗(yàn)器材的準(zhǔn)備
1.輸精管切除術(shù)用器材：彎式有齒鑷、直式有齒鑷、顯微鑷、手術(shù)剪、自動(dòng)小夾涂藥器、自動(dòng)小夾、帶彎針4/0絲線及持針器、直徑為10cm塑料 Petri氏培養(yǎng)皿（內(nèi)盛70%乙醇）。
2.手術(shù)前麻醉:2，2，2 三溴乙醇（阿佛?。┦窍喈?dāng)有效的麻醉劑。因該試劑對(duì)光敏感，所以應(yīng)該于4度避光保存，新試劑用前應(yīng)進(jìn)行測(cè)試。經(jīng)腹腔注射三溴乙醇麻醉小鼠后，為了使麻醉劑盡快發(fā)生作用，將小鼠放回原籠熟悉的環(huán)境中，小鼠將會(huì)更容易松馳下來(lái)。 擠壓小鼠腳墊，如果小鼠能感覺(jué)到此刺激，小鼠將從擠壓部位開(kāi)始縮腿運(yùn)動(dòng)（pedal reflex），用此方法可以檢察是否麻醉完全。實(shí)驗(yàn)中小鼠無(wú)縮腿運(yùn)動(dòng)、小鼠達(dá)到手術(shù)所需的麻醉深度以及程度方可開(kāi)始手術(shù)。
三溴乙醇的反復(fù)使用可能引起小鼠腹膜刺激征或者炎癥反應(yīng)。其他麻醉劑中，克他命/甲苯噻嗪在獸醫(yī)界廣泛應(yīng)用，另外，克他命/美托咪定也越來(lái)越受到青睞，特別是在美國(guó)。我國(guó)一些實(shí)驗(yàn)室用戊巴比妥鈉的效果好,特別是尾靜脈注射控制很方便.30g左右小鼠用0.85%的戊巴比妥鈉0.3ml左右。
3. 受精卵的采集用器材：70%乙醇、手術(shù)剪、10mL解剖剪、手術(shù)鑷、M2溶液（Sigma）、小玻璃皿等。
4. 離體輸卵管中受精卵收集用器材：二氧化碳孵育箱、眼科鑷子、5號(hào)鑷子、無(wú)菌30-mm組織培養(yǎng)皿、解剖顯微鏡、透明質(zhì)酸酶、移液管、工作液、M16溶液（Sigma）、3ml注射器等。
5. DNA顯微注射用器材
（1）受精卵的收集與移動(dòng)用器材：巴氏移液管、酒精燈、特制吸管、玻璃刀等。
（2）凹玻片準(zhǔn)備：一塊標(biāo)準(zhǔn)的凹型載玻片（硅化）、礦物油（Sigma）、工作液等。
（3）注射設(shè)備的設(shè)置：微型水力驅(qū)動(dòng)設(shè)備、Hamilton Gas-Tite™注射器（250 l）、Intramedic™管道系統(tǒng)（外徑1.27mm，內(nèi)徑0.86mm）、兩只玻璃管道連接頭、三通管連接器、一只帶接頭的60ml塑料注射器、一只器械套管、礦物油等。
（4）受精卵的顯微注射用器材：凹玻片（顯微注射用）、倒置立體相差顯微鏡l漢密爾頓注射器）、氣壓裝置(50ml充滿氣體的注射器)?或倒置Nomarski立體光學(xué)顯微鏡、顯微操縱器、千分尺（連接添滿礦物油，且耐氣構(gòu)造的250 、持卵管、預(yù)載DNA的注射針等。
6.輸卵管轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)備
（1）手術(shù)試劑器材：麻醉劑（阿佛丁或可他命/甲苯噻嗪）、70%乙醇、一副鈍性齒鑷、兩副5號(hào)精細(xì)鑷子、一副10cm手術(shù)剪、帶自動(dòng)小夾的金屬大剪、一個(gè)小彈簧夾、外科縫線、解剖顯微鏡、纖維光學(xué)照明器、載針頭的1ml注射器、kimwipe綿紙或外科紗布、9cm 塑料皿、工作液、移液管和手動(dòng)移卵管等。所有的手術(shù)器械在使用前應(yīng)該徹底清洗，70%乙醇消毒或高熱滅菌處理。
（2）受體母鼠的準(zhǔn)備：輸卵管轉(zhuǎn)移的受體鼠應(yīng)該為4-6周齡大小，體重在20-25克左右，嚴(yán)禁用低體重以及超重母鼠，若體重較低，其體能不足以維持妊娠，可能導(dǎo)致受精卵的重新吸收；若體重較重，麻醉劑被吸收入脂肪組織，降低麻醉效果，可能使手術(shù)困難，而且脂肪組織的存在意味著靜脈的存在，所以手術(shù)時(shí)切掉脂肪組織可能導(dǎo)致不必要的出血，難以確認(rèn)手術(shù)時(shí)的操作對(duì)象。出血也可能堵塞移卵管。選擇輸卵管轉(zhuǎn)移前一天晚上與切除輸精管小鼠交配的假孕母鼠，注射當(dāng)天早上母鼠可見(jiàn)精栓。盡管像Swiss Webster系的哺育母鼠很容易超重，隨著體重的增加，它們將表現(xiàn)出不同程度的感覺(jué)消失，但它們是優(yōu)良的哺育母鼠。另外，它們的價(jià)格也便宜。另一個(gè)成功的鼠系是B6D2F1，它們生命力強(qiáng)并有一定雜合優(yōu)勢(shì)。
（3）麻醉劑：阿佛丁被證明是輸卵管轉(zhuǎn)移手術(shù)的有效麻醉劑。
實(shí)驗(yàn)操作程序和方法
1．鼠系克隆
（1）動(dòng)情期的探測(cè)：在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立中母鼠動(dòng)情期的監(jiān)測(cè)有很高的技巧性。小鼠的動(dòng)情期主要?jiǎng)澐譃樗膫€(gè)時(shí)期：
① 動(dòng)情后期：陰道口無(wú)擴(kuò)張，周圍組織為灰白色，陰道口周圍無(wú)膨大
② 間情期：陰道開(kāi)口小，周圍組織為灰色或藍(lán)色
③ 動(dòng)情前期：陰道口逐漸擴(kuò)張，陰道周圍組織由粉紅色變?yōu)榧t色。
④ 動(dòng)情期：陰道周圍組織顏色由紅色轉(zhuǎn)為粉紅色，陰道口背側(cè)唇可見(jiàn)條紋，陰道口腹側(cè)唇可見(jiàn)腫大，陰道有分泌液外滲。
隨機(jī)選擇動(dòng)物，任何時(shí)間都可能有20%-25%的動(dòng)物處于動(dòng)情期。大多鼠科動(dòng)物的動(dòng)情期平均持續(xù)4-5天，所以對(duì)群居性動(dòng)物的個(gè)體進(jìn)行動(dòng)情周期的同步化處理后可能在任一時(shí)期產(chǎn)生大量發(fā)情動(dòng)物。動(dòng)情期動(dòng)物的選擇需兩個(gè)指標(biāo)：陰道周圍組織色澤和組織膨脹的程度。動(dòng)情期動(dòng)物陰道組織深粉紅色，但并不同于炎癥時(shí)的色澤。另外，陰道口周圍背腹部組織腫脹而有光澤，起初其腹部可見(jiàn)條紋。個(gè)別陰道口組織色澤較深，但無(wú)膨脹，或陰道口稍微擴(kuò)大且略帶灰色者為非動(dòng)情期動(dòng)物，切勿誤選它們用于交配。
（2）交配的確認(rèn)：陰栓形成。動(dòng)物合籠后，確定雄性個(gè)體是否與母鼠成功交配非常有必要。由于雄性精液可在陰道內(nèi)凝固成柔軟栓性物，成功交配后不久有陰道栓形成。以手的中指、小指和拇指捏住雌性尾根處，使小鼠頭部向下，仔細(xì)觀察陰道口部位，交配過(guò)的雌性小鼠可見(jiàn)有白色橡皮擦狀的陰道栓，易肉眼所見(jiàn)，難以確定時(shí)可用小探針檢查陰道深部是否有栓子存在。檢查陰栓應(yīng)在每天早上的早些時(shí)間，因?yàn)殡S著時(shí)間的推移，陰栓將被排出體外。
2．輸精管切除術(shù)：輸精管切除小鼠用于與晶胚轉(zhuǎn)移母鼠交配使母鼠假孕。小鼠6-8周齡進(jìn)行輸精管切除術(shù)，CD-1 B6D2F1(C57BL6 *DBA/2)或Swiss Webster系是通常的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。阿佛丁腹腔注射麻醉劑量為240mg/kg。
（1）稱重后麻醉小鼠，背位固定小鼠，大剪刀貼近皮膚剪毛，70%的乙醇涂 搽消毒手術(shù)切口部位，以防止毛發(fā)污染切口。
（2）于生殖器前方大約1.3cm處橫行剪開(kāi)下腹部皮膚，作約1cm的切口， 用浸70%乙醇的紗布搽拭切口部位以清理毛發(fā)。
（3）切開(kāi)腹膜，進(jìn)行膀胱定位。每側(cè)都可見(jiàn)有一條管道走行，用鑷子輕輕夾持左側(cè)管道，提起部分使手術(shù)視野清晰可見(jiàn)，確定其為輸精管。
（4）將鑷子插進(jìn)輸精管下方，使它們處于自然狀態(tài)，其末端垂直。同時(shí)在該位置兩端用縫線結(jié)扎輸精管，距離大約4-5毫米。在兩結(jié)扎點(diǎn)間剪斷輸精管，置其于紗布上確定此側(cè)手術(shù)完畢。
（5）將輸精管兩個(gè)斷端輕輕放回腹腔，如上處理右側(cè)輸精管。兩側(cè)手術(shù)完畢后，2-3根單獨(dú)縫線縫合腹壁切口。待用縫線須浸泡在70%乙醇中，保持縫線濕潤(rùn)，防止結(jié)扎時(shí)粘附組織。用兩個(gè)或三個(gè)自動(dòng)小夾夾閉皮膚。
（6）為保暖包裹小鼠于紗布中或?qū)⑵浞胖糜跓釅|內(nèi)使其蘇醒，處于麻醉狀態(tài)下的小鼠應(yīng)該嚴(yán)格監(jiān)護(hù)直到其完全蘇醒。手術(shù)后小鼠飼養(yǎng)2周后確定手術(shù)是否成功。
（7）實(shí)驗(yàn)性飼養(yǎng)：將1-2只母鼠與輸精管切除小鼠合籠飼養(yǎng)，次晨進(jìn)行陰道栓檢查。有陰道栓的母鼠，用磷酸緩沖液處理后24小時(shí)，其輸卵管潮紅。卵細(xì)胞應(yīng)該處于單細(xì)胞期或未受孕狀態(tài)，若處于雙細(xì)胞期，則輸精管切除未完全，雄性小鼠應(yīng)進(jìn)行再篩選。
3．受精卵的收集
（1）受精卵的采集：受精卵獲得的方法分自然排卵和激素誘發(fā)排卵以及體外受精三種方法。本章對(duì)誘發(fā)排卵法給予介紹。
誘發(fā)排卵法：雌性小鼠生后6—8周達(dá)到性成熟，性周期均為4—5 日，其排卵時(shí)間可用飼養(yǎng)室的明亮和黑暗進(jìn)行調(diào)節(jié)，所以必須對(duì)飼養(yǎng)室的明暗規(guī)律進(jìn)行準(zhǔn)確嚴(yán)格地管理。
性周期是卵泡刺激素和黃體生成素相互作用的結(jié)果，我們可以從外部給予這些激素誘發(fā)排卵。向成熟雌小鼠腹腔內(nèi)注射5國(guó)際單位(IU)的孕馬血清促性腺激素(PMSG)之后，約在48—54h后再將2.5-5.0 IU的人絨毛膜促性腺激素(hCG)注射于同一小鼠腹腔內(nèi)，約12h后即可誘發(fā)排卵。排卵數(shù)量可達(dá)自然排卵的2倍，效果很好。雌小鼠給予hCG后應(yīng)立刻與雄性合籠。成熟雄小鼠應(yīng)按每籠飼養(yǎng)1只，雄性小鼠大小在12周齡到1年。合籠時(shí)，須將激素化雌性小鼠放進(jìn)雄小鼠的籠中。雄小鼠釋放促雌性發(fā)情的外激素，在交配過(guò)程中建議不換籠，交配過(guò)的雄小鼠，間隔一周后才進(jìn)行下次交配。
顯微注射的受精卵最好于交配后次晨注射前幾小時(shí)收集，此時(shí)易進(jìn)行注射操作。交配后過(guò)夜小鼠的陰道栓易見(jiàn)，可用交配指示劑指示。對(duì)超排卵的交配母鼠體內(nèi)進(jìn)行陰道栓計(jì)數(shù)一般正常。低比率的有栓母鼠說(shuō)明促性腺激素失去效力或雄性小鼠交配過(guò)度或雄性小鼠老齡化。收獲受精卵必須打開(kāi)小鼠腹腔，輸卵管必須仔細(xì)切開(kāi)。輸卵管沖洗術(shù)或輸卵管壺部切開(kāi)術(shù)都可作為收集受精卵的方法。
（2）腹腔內(nèi)輸卵管的切開(kāi)
1）通過(guò)斷頸或二氧化碳吸入快速處死小鼠。
2）將動(dòng)物背位固定在無(wú)菌干燥的吸水紙上，剪毛并用70%的乙醇徹底涂搽手術(shù)部位。以避免毛發(fā)污染手術(shù)視野。
3）持眼科鑷捏緊下腹部正中線皮膚，用外科剪作小的橫切口，剪刀鈍性分離充分暴露手術(shù)視野，或鈍性撕開(kāi)皮膚暴露腹膜。用眼科剪打開(kāi)腹膜，充分暴露腹腔與子宮角部手術(shù)視野。子宮為Y形，為起自盆腔膀胱后的肌性器官，向上分支為兩側(cè)子宮角，向上橫行深入腹腔。
4）用鑷子距輸卵管卵巢6-7mm處夾持子宮角翻轉(zhuǎn)后輕輕拖出腹腔，在鑷子捏點(diǎn)下部子宮角下方附近刺破腸系膜，清除腸系膜組織遠(yuǎn)離子宮角與輸卵管，并防止用力過(guò)大壓破子宮角與輸卵管連接處。
5）用鑷子拖出脂肪墊，卵巢，輸卵管以及子宮部件。小心剪掉卵巢與輸卵管之間的薄層膜，然后剪下輸卵管和部分子宮角，將其盛放在盛工作液的小玻璃皿中，對(duì)另一側(cè)輸卵管重復(fù)上面操作，完畢后如上處理下一只動(dòng)物。
（3）離體輸卵管內(nèi)受精卵的收集：解剖鏡下觀察近輸卵管漏斗部上部明顯潮紅此為壺腹部。用眼科鑷子撕開(kāi)膨大的壺腹部即看到包繞受精卵的丘細(xì)胞團(tuán)。
1）轉(zhuǎn)移輸卵管于含工作液的小玻璃皿中。
2）眼科鑷子夾持壺腹部，并用另一只眼科鑷子撕開(kāi)膨大的輸卵管，游離的受精卵慢慢流出，也可以用鑷子輕輕擠壓輸卵管將受精卵推出裂口。
（4）透明質(zhì)酸酶處理與受精卵的漂洗
工作液中受精卵可能成團(tuán)狀，微注射用的受精卵必須是單個(gè)細(xì)胞，而且無(wú)細(xì)胞碎片。漂洗細(xì)胞時(shí)，首先用工作液除去細(xì)胞碎片。不成團(tuán)細(xì)胞可用無(wú)菌移液管收集到盛工作液的玻璃小皿中，注意把握移液管的張力。溶解在工作液中的透明質(zhì)酸酶對(duì)細(xì)胞團(tuán)以及復(fù)合體進(jìn)行消化時(shí)必須嚴(yán)密觀察，一旦細(xì)胞團(tuán)溶解立即將單細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮工作液中，防止消化過(guò)度。
用工作液漂洗2-3次，清除碎片后，用無(wú)菌移液管將受精卵置于特殊培養(yǎng)基（M16），放于37CO2孵箱中待注射，此培養(yǎng)基上層覆蓋高壓消毒礦物油，可防止污染同時(shí)防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)影響pH。受精卵在體外發(fā)育較體內(nèi)快，在孵育過(guò)程中注意觀察一些受精卵清晰可見(jiàn)原核形成，在此期間可先選出原核清晰的卵(形態(tài)稍不規(guī)則)用于注射，其它卵繼續(xù)培養(yǎng)。注射后，再篩選，再注射，直至得到滿意的注射卵數(shù)。
4．顯微注射
（1）導(dǎo)入DNA的制備：顯微注射首先涉及導(dǎo)入DNA的制備，顯微注射的轉(zhuǎn)入基因通常為去除載體序列的線狀DNA，轉(zhuǎn)基因所用載體是真核表達(dá)載體，即含有在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的真核啟動(dòng)子。所謂組織特異性的實(shí)現(xiàn)多是通過(guò)組織特異性啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)組織特異性表達(dá)的。制備轉(zhuǎn)基因小鼠，必須對(duì)待導(dǎo)入DNA進(jìn)行分離純化。實(shí)驗(yàn)必須用經(jīng)過(guò)瓊脂糖電泳鑒定并確定其純度的DNA，對(duì)導(dǎo)入基因的大小沒(méi)有特別的限制，長(zhǎng)鏈DNA也可成功。 實(shí)驗(yàn)中注意防止一些雜質(zhì)堵塞注射針，如瓊脂糖顆粒、纖維物質(zhì)等，需盡量超速離心除去。
DNA的注射質(zhì)量是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。研究表明DNA注射的起始濃度大約在1ng/ml，當(dāng)DNA注射濃度超過(guò)一定上限時(shí)，實(shí)驗(yàn)效果不佳，而且大于5 ng/ml會(huì)產(chǎn)生明顯的毒性作用。
導(dǎo)入DNA的制備程序如下：
1）通過(guò)在Tris/acetate/EDTA緩沖液中進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳從載體中分離待插入DNA，用5mg/ml溴乙啶染色。
2）為防止對(duì)插入DNA的溴乙啶的破壞，用長(zhǎng)波紫外光顯影。
3）切下目的基因所在凝膠片，電泳制備目的DNA，或用Qiaex凝膠抽提試劑盒進(jìn)行抽提。
4）乙醇沉淀目的DNA。在樣品中加入1/10體積的3M乙酸鈉，混勻，再加入2-2.5倍體積無(wú)菌100%乙醇進(jìn)行沉淀。
5）-200C 孵育過(guò)夜后，超速離心機(jī)10000轉(zhuǎn)/分，離心5分，收集沉淀，重懸沉淀于Elutip緩沖液。
6）用Elutip-D微型柱對(duì)目的DNA過(guò)柱處理。
7）按照步驟4重新沉淀DNA，用70%乙醇漂洗沉淀2-3次，真空干燥沉淀。清洗與干燥過(guò)程極其重要，因?yàn)闅堄嗟柠}和乙醇對(duì)受精卵的發(fā)育是致命的。
8）注射緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, pH 7.5）重懸沉淀，緩沖液必須是Milli-Q純化水配制
9）通過(guò)熒光光度計(jì)或凝膠電泳比色法評(píng)估目的DNA的濃度l.μ
10）用注射緩沖液調(diào)整目的DNA的濃度在5-10ng/
（2）器械準(zhǔn)備
[注射針的制作]
注射針是內(nèi)含玻璃細(xì)絲的薄壁毛細(xì)吸管，它可以通過(guò)毛細(xì)管虹吸作用進(jìn)行載樣。用拉針儀（SUTTER,P2000 laser based micropipette puller,具體操作程序詳見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書）可以把注射針?biāo)交虼怪背断聛?lái)。必須保證制備的毛細(xì)管可以進(jìn)入拉針儀這樣加熱組件大約在毛細(xì)管的中央位置。一般用內(nèi)徑為1.0mm的微電極管為材料制作注射針,微電極管可以買到,它與拉針儀是匹配的。另外，應(yīng)該對(duì)拉針儀的設(shè)置進(jìn)行選擇，使細(xì)絲溫度和扯拉力度(主拉力和次拉力)將處于最佳狀態(tài)。具體需要預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定其最佳設(shè)置。待用注射針應(yīng)該用蒸餾水嚴(yán)格清洗以除去殘留炭化物顆粒。嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)微電極管在使用前應(yīng)經(jīng)過(guò)泡酸、泡蒸餾水和硅化的程序,但有人省略了此步也有較好的結(jié)果,經(jīng)拉針儀拉針后就沒(méi)法清洗,好的拉針儀是不會(huì)殘留炭化物顆粒,若拉成后清洗其針尖很容易斷掉,可用Narishige Japan model PN-30。
[持卵管制作]
m左右,內(nèi)徑要能吸住受精卵,而又不把卵吸入管內(nèi)。為便于操作，持卵管可進(jìn)一步調(diào)整使其末端輕微彎曲（15度）。?m。持卵管的內(nèi)徑很重要,可用鉑金燈絲灼燒管口,使其內(nèi)徑為30-50?為避免機(jī)械損傷，持卵管口應(yīng)該是鈍性末端而且其孔隙有限，使受精卵輕輕依附在負(fù)壓管道中。這種高度密實(shí)可抵抗密封系統(tǒng)的破損，而密封可以減少受精卵注射時(shí)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。持卵管的口部應(yīng)該光滑，平整及與其長(zhǎng)軸垂直。具體制備操作：雙手執(zhí)毛細(xì)玻璃管的兩端，將管的中部置酒精燈外焰燒紅至變軟后離開(kāi)火焰，同時(shí)雙手外伸，將燒軟的部分拉細(xì)。用玻璃刀或細(xì)沙輪小心將細(xì)管切開(kāi)，在鏡下觀察切口應(yīng)平齊(如不平齊，應(yīng)重新切割)。然后于酒精燈火焰底部的藍(lán)焰邊緣處將切口鈍化處理(即將管口于藍(lán)焰邊緣處做短暫灼燒，然后于顯微鏡下檢查管口形狀，如此反復(fù)，直至滿意)。如實(shí)驗(yàn)室配有持卵管制作儀，則可在顯微鏡下直接監(jiān)視熱燈絲對(duì)持卵管管口灼燒后的形狀，及時(shí)調(diào)整二者之間的相對(duì)位置，更易得到滿意的持卵管。持卵管應(yīng)該做調(diào)整，用熔斷儀將其打彎使其末端成15度(不同的顯微注射儀度數(shù)可能有差異,打彎成25度左右,一般為20-25度)輕微彎曲以方便使用。此持卵管為不含細(xì)絲的玻璃，顯微鏡下用含刻度目鏡確定持卵管的外徑應(yīng)該為100-140
[洗卵管制作]
1）點(diǎn)燃酒精燈，調(diào)節(jié)火焰到最佳。捏持玻璃毛細(xì)吸管或巴氏移液管在火焰上焰旋轉(zhuǎn)過(guò)火。
2）l的吸管。注意制備過(guò)程中離開(kāi)火焰的時(shí)間以及扯拉的力度，盡量保證制備吸管的一致性。?當(dāng)吸管開(kāi)始變軟，快速撤離火焰，向外急劇扯拉使吸管變長(zhǎng)，形成口徑大約200
3）為吸管評(píng)分，輕柔地折斷吸管，辨別其聲音是否清脆，或扯拉吸管或只做彎曲直到兩根同分?jǐn)?shù)的吸管斷裂為止。
4）解剖鏡下(要在熔斷儀上)檢查吸管，并對(duì)其進(jìn)行調(diào)整，確定其口徑以及管口光滑平整。
[移卵管的制作]
用于轉(zhuǎn)移注射后受精卵到假孕鼠體內(nèi)的吸管制作過(guò)程同上洗卵管。不同的是，這些吸管的口徑稍微小一些，大約150 m(150-160m)，直徑比單受精卵的口徑略大一些，將促使卵細(xì)胞精細(xì)的充滿移卵管并轉(zhuǎn)移到輸卵管。移卵管在打磨過(guò)程中要求管口更光滑平整以減輕插入輸卵管時(shí)對(duì)輸卵管的損傷，同時(shí)必須注意移卵管頭在火焰上時(shí)間不可太長(zhǎng)，防止融化堵塞。管口要平且要鈍化。
[凹玻片的準(zhǔn)備]
必須準(zhǔn)備適合承載用于微注射的受精卵的凹玻片做微注射槽，也可用培養(yǎng)皿做注射槽，載玻片上的受精卵應(yīng)該浸潤(rùn)在pH緩沖工作液中，如M2溶液，使受精卵在孵箱外保持30-40分能受到保護(hù)。具體凹玻片的準(zhǔn)備程序如下：
1）在超凈臺(tái)內(nèi)利用手動(dòng)移液器將M2溶液加入凹玻片窩的基底部形成直徑大約0.6cm液面，液滴的液面要水平平整，避免液體的折射效應(yīng)。吸取胚胎實(shí)驗(yàn)用礦物油于M2溶液上，礦物油的量以剛剛達(dá)M2溶液最高液面為宜，將凹玻片置于倒置顯微鏡的載物臺(tái)上，在低倍鏡下調(diào)節(jié)焦距，使M2溶液液滴的底面清楚為止。
2）覆蓋礦物油的作用：防止液滴脫水以及濃縮；使受精卵處于無(wú)菌狀態(tài)；固定M2溶液液滴。
3）從孵箱中取出受精卵，用移卵管吸出受精卵并用M2溶液洗滌2-3次，調(diào)整實(shí)驗(yàn)用量，將其置于凹玻片的M2溶液中，調(diào)焦使在低倍鏡下清楚地看到受精卵的輪廓，并且保證受精卵有足夠空間自由移動(dòng)，用持卵器將卵匯聚到一起，移卵時(shí)注意不要將氣泡移入，影響操作視野。
[顯微注射設(shè)備]
顯微注射儀的基本工作原理是運(yùn)用立體倒置相差顯微鏡進(jìn)行觀察監(jiān)測(cè)，顯微鏡兩側(cè)各置一臺(tái)顯微操作儀，一側(cè)接持卵管，另一側(cè)接注射針，可調(diào)節(jié)持卵管或注射針的空間位置。持卵管通過(guò)塑料管連接一個(gè)裝滿礦物油的帶微調(diào)的注射器，通過(guò)調(diào)節(jié)壓力控制卵的運(yùn)動(dòng)。注射針通過(guò)塑料管連接有壓力泵的注射儀。將注射時(shí)間與壓力固定后，進(jìn)行注射操作。操作系統(tǒng)有LEICA AS TP基因轉(zhuǎn)殖操作系統(tǒng)（major instruments.co.Ltd）等，具體操作程序按其說(shuō)明書嚴(yán)格進(jìn)行。
（3）注射針內(nèi)DNA的裝載
把注射針的鈍性頭浸在盛待注射DNA的管中，溶液通過(guò)毛細(xì)吸管的虹吸作用進(jìn)入注射針。注射針的末端應(yīng)該一直留在DNA溶液中直到注射針末端有小泡形成。這說(shuō)明DNA溶液裝載完畢。仔細(xì)檢查注射針針頭末端，距其幾毫米處可見(jiàn)一個(gè)小凹液面。最后可將載滿DNA溶液的吸管裝在持針器或固定在器械環(huán)中待用。
（4）受精卵的顯微注射
受精卵的顯微注射過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，制作大量樣品過(guò)程中，為保證顯微注射量的一致性，必須通過(guò)大量反復(fù)有效的練習(xí)才可以成功。
1）置凹玻片于顯微鏡下，低倍聚焦。
2）調(diào)節(jié)持卵管，注射針與受精卵在同一視野下后，轉(zhuǎn)換到高倍鏡（32X）下時(shí)位置稍微低于受精卵，以便自如地操作受精卵。
3）挨近注射針到工作液或油界邊緣，稍微進(jìn)入油界。在注射前，增加注射針的壓力可見(jiàn)DNA溶液泡在油內(nèi)形成囊狀，以此確定DNA溶液流存在。
4）如果未見(jiàn)DNA溶液流，則輕輕摩擦持樣器鈍緣，漸漸的打開(kāi)注射器針頭。針頭重新進(jìn)入油內(nèi)確定DNA溶液流的存在。
5）移動(dòng)持卵管回到受精卵下部。通過(guò)微分驅(qū)動(dòng)水壓控制系統(tǒng)使持卵管內(nèi)產(chǎn)生溫和的負(fù)壓，并使持卵管末端吸住受精卵。此操作必須確保受精卵基底部與凹玻片基底部輕輕接觸。注意不宜吸得過(guò)緊，否則會(huì)使卵變形，甚至?xí)⒙盐顺致哑鲀?nèi)。
6）對(duì)持卵管內(nèi)真空進(jìn)行緩慢調(diào)節(jié)，使持卵管內(nèi)受精卵輕柔地旋轉(zhuǎn)，使卵內(nèi)原核位于持卵管口的遠(yuǎn)側(cè)端。
7）維持持卵管穩(wěn)定，使注射針的針頭緊靠受精卵的透明帶，進(jìn)行調(diào)節(jié)并使針與原核處于同一平面上。用注射針依次刺破透明帶，細(xì)胞外膜，前核核膜，進(jìn)入核膜內(nèi)，受精卵的透明帶易被針尖刺破，前核核膜相當(dāng)有彈性，應(yīng)用不同的方法進(jìn)行嘗試突破此結(jié)構(gòu)。操作時(shí)避免與核接觸損傷核仁。
8）保持注射針位置固定，輕輕增加壓力使DNA溶液流入前核中。注射過(guò)程中可能出現(xiàn)的現(xiàn)象如下：
① 注射后原核將膨大到原來(lái)的兩倍左右，表明注射成功，然后直接抽出注射針。
② 一氣泡出現(xiàn)在注射針尖端，透明帶可能膨脹，表明受精卵的膜非常艱固，沒(méi)有被刺破，此時(shí)需繼續(xù)向內(nèi)進(jìn)針，直到尖端進(jìn)入核，同時(shí)要小心注射針尖端極易破損。
③ 注射針壓力較大，看不到任何現(xiàn)象，可能是注射針堵塞，需換針或更換DNA溶液。
④ 若見(jiàn)胞質(zhì)顆粒涌出到卵黃周圍空間，說(shuō)明受精卵破裂。注射過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)卵破裂數(shù)目較多，則需更換注射針。一支注射針一般可注射5—10枚卵。
9）用持卵器移動(dòng)受精卵到凹玻片凹內(nèi)相對(duì)隔離的位置，以區(qū)分注射組與非注射組。重新安裝持卵管并進(jìn)行下一組操作。
5．受精卵的輸卵管轉(zhuǎn)移
（1）受精卵的輸卵管注射
1）將麻醉小鼠放置于一塑料平皿蓋上，固定小鼠牙齒于皿緣以確保小鼠氣道通暢。用70%乙醇涂搽切口部位。也可預(yù)先在手術(shù)部位剔除毛發(fā)。
2）將受精卵從培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至工作液內(nèi)。因受精卵在轉(zhuǎn)移過(guò)程中在孵箱外操作，所以應(yīng)該將其從培養(yǎng)基中移到工作液中。
4）用移卵管裝載受精卵。移卵管的正確裝載對(duì)輸卵管轉(zhuǎn)移的成功非常重要。如圖11-1所示，吸取一定量的工作液在移卵管尖端，然后吸取些許空氣制成一個(gè)小氣泡。再吸取與氣泡體積大約相當(dāng)?shù)墓ぷ饕海o接著在吸取另外一個(gè)小氣泡。收集受精卵于盡可能小容積的工作液中，將其線形排列于移卵管中。當(dāng)所有的卵被負(fù)載后，再吸取小量氣體制成小氣泡，接著吸取最終容量的工作液。氣泡將有利于對(duì)壓力進(jìn)行調(diào)節(jié)，更容易使卵移動(dòng)。
5）手術(shù)暴露輸卵管復(fù)合體。如圖所示，在離中線約0.5厘米、背駝峰與后腿髖關(guān)節(jié)之間作橫行切口。仔細(xì)用浸70%乙醇涂搽切口部位，并搽去毛發(fā)。捏住一側(cè)切口皮膚，鈍性分離皮下組織。移動(dòng)皮膚直到腹壁神經(jīng)走行清晰可見(jiàn)。這時(shí)可看到腹壁下紅色卵巢或淺色卵巢脂肪墊。用眼科鑷捏住腹壁，并作約0.5厘米橫行切口，鈍性分離組織，輕輕移出脂肪墊、卵巢、輸卵管以及子宮。用彈簧夾夾住脂肪墊并保持子宮在適當(dāng)位置。若子宮及子宮角頻繁滑回腹腔，在保證氣道通暢的前提下，可適當(dāng)重新布置其位置。
6）輕輕移動(dòng)塑料平皿，使小鼠位于解剖顯微鏡下，適當(dāng)調(diào)節(jié)顯微鏡及小鼠位置使其輸卵管卷曲部清晰可見(jiàn)。
7）用眼科鑷于漏斗部透明囊膜處鈍性撕開(kāi)小口，并防止撕裂血管，引起出血。必要是撕裂口部位局部應(yīng)用腎上腺素以減少出血，并用紗布擦拭保持操作視野干凈。
8）一旦漏斗部清晰可見(jiàn)，用鑷子夾持其邊緣并充分暴露漏斗管口。在避免壺腹損傷的前提下，盡可能插入移卵管。
9）在壓力可調(diào)節(jié)的前提下，輕輕把卵吸吹進(jìn)入漏斗部。氣泡可以阻止卵回流而且很容易使卵進(jìn)入輸卵管漏斗管。若吹卵的壓力太大，那么移卵管口可能抵在輸卵管壁上，這時(shí)可稍微后撤移卵管再進(jìn)行操作，也可能由于血塊堵塞移卵管，若這樣，則應(yīng)該吹出細(xì)胞在培養(yǎng)皿中，重新吸卵。
10）移卵操作完成后，撤回移卵管，去除器械，按原本位置將各器官重置于腹腔內(nèi)。
10）縫合切口，用小夾夾持皮膚。常用自動(dòng)小夾代替縫線，這樣可以避免小鼠啃嘶縫線，切口裂開(kāi)。
11）若進(jìn)行雙側(cè)手術(shù)，則于另一側(cè)子宮角重復(fù)上述操作。
12）手術(shù)完成后，安置小鼠于清潔的籠中。麻醉狀態(tài)下，小型哺乳動(dòng)物無(wú)法有效維持機(jī)體溫度。所以應(yīng)該注意小鼠的保溫?？梢杂脽釅|保持其溫度直到動(dòng)物蘇醒。所有的動(dòng)物在回籠前20-30分可蘇醒。由于妊娠很容易使受體母鼠產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致流產(chǎn)或食子，所以對(duì)受體母鼠必須嚴(yán)格監(jiān)護(hù)。
（2）注射后期監(jiān)護(hù)：手術(shù)后嚴(yán)格監(jiān)護(hù)防止并發(fā)癥的發(fā)生非常重要。麻醉易誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)血壓升高，所以手術(shù)后必須嚴(yán)密監(jiān)護(hù)至少2小時(shí)，同時(shí)推薦進(jìn)行保溫處理。
處于麻醉狀態(tài)的小鼠應(yīng)該用軟紗布包裹，而且籠中加墊草墊以及軟材料，并保持鼠籠溫度。正常體溫的維持可以縮短動(dòng)物處于麻醉狀態(tài)的時(shí)間。
手術(shù)后小鼠常規(guī)4-5天觀察一次以確保小鼠處于恢復(fù)中，清醒小鼠應(yīng)活動(dòng)自如。腹腔手術(shù)后小鼠有發(fā)生腸疝的可能。所以手術(shù)時(shí)保持切口盡量小，縫合嚴(yán)密，而組織膠水的正確應(yīng)用可以避免此類并發(fā)癥的發(fā)生。皮膚必須用縫線或不銹剛夾夾閉，手術(shù)后1-2周可拔除。如果動(dòng)物狀態(tài)不良，表現(xiàn)厭食，脫水，或明顯弓背，通過(guò)動(dòng)物飲水可給予羥苯基乙酰胺以及同類止疼藥。若發(fā)生脫水，可腹腔注射0.9%生理鹽水或林格氏液。若仍無(wú)改善可在麻醉狀態(tài)下重新打開(kāi)手切口確認(rèn)是否有疝發(fā)生。若動(dòng)物狀態(tài)無(wú)明顯好轉(zhuǎn)，最終采用安樂(lè)死進(jìn)行。
轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
產(chǎn)出的鼠仔中，屬轉(zhuǎn)基因小鼠者，約占全部仔小鼠的20％-30％。因此，對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠必須進(jìn)行鑒定篩選。
1．轉(zhuǎn)基因整合檢測(cè)
鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠最簡(jiǎn)單的方法是從小鼠尾尖提取基因組DNA，檢測(cè)其基因型。檢測(cè)方法包括PCR和Shouthern雜交。
（1）基因組DNA的提?。?br /> 1）將離乳期小鼠（>4周齡）麻醉標(biāo)記。
2）用一只手抓住小鼠，另一只手持消毒剪剪下約1cm的鼠尾。
3）將剪下的鼠尾放入500l消化緩沖液中（50mmol/L Tris-HCl, pH8.0; 100mmol/LEDTA; 100mmol/LNaCl; 1%SDS）, 并加入蛋白酶K使其終濃度為100g/ml，550攝氏度下震蕩孵育3~4小時(shí)或過(guò)夜孵育。
4）加入5lRNA酶A，370C孵育1~2小時(shí)。
5）DNA的分離純化步驟參見(jiàn)第一章的第三節(jié)。
（2）PCR檢測(cè)：轉(zhuǎn)基因的初始篩選通常采用PCR檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便、快速、費(fèi)用低而有效，適合大量標(biāo)本的分析。由于該技術(shù)特別敏感，可能產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。因此，在操作過(guò)程中必須特別小心，避免質(zhì)粒DNA或其它標(biāo)本的基因組DNA的污染。假陽(yáng)性的產(chǎn)生對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠的篩選工作將是致命的。PCR實(shí)驗(yàn)應(yīng)采用雙復(fù)管，甚至三復(fù)管。陽(yáng)性結(jié)果最好用Southern雜交技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)。PCR的實(shí)驗(yàn)操作參見(jiàn)第一章的第六節(jié)。
（3）Southern blot分析：該技術(shù)雖然沒(méi)有PCR技術(shù)那樣敏感，且費(fèi)力費(fèi)時(shí)，但是避免了因污染導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的麻煩，可以得到目的基因整合后的基因組、整合位點(diǎn)數(shù)目、轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)等的確切信息。Southern blot的實(shí)驗(yàn)操作參見(jiàn)第一章的第八節(jié)。
2．轉(zhuǎn)基因表達(dá)檢測(cè)
轉(zhuǎn)基因整合檢測(cè)是確定目的基因是否整合到了小鼠的基因組中，同時(shí)可確定整合的位點(diǎn)和拷貝數(shù)，這在遺傳學(xué)上是十分重要的。而轉(zhuǎn)基因表達(dá)檢測(cè)是確定目的基因在轉(zhuǎn)基因小鼠器官組織中表達(dá)的時(shí)空分布。其檢測(cè)包括RNA分析技術(shù)和蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)。
（1）RNA的分離：根據(jù)實(shí)驗(yàn)者的需要從轉(zhuǎn)基因小鼠組織或細(xì)胞中提取總RNA或mRNA。分離總RNA比較簡(jiǎn)單，且適合做基因做基因轉(zhuǎn)錄分析。實(shí)驗(yàn)操作參見(jiàn)第一章的第四節(jié)。
（2）Northern 印跡分析：該技術(shù)用于定性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物組織或細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄的相對(duì)水平。其實(shí)驗(yàn)操作參見(jiàn)第一章的第九節(jié)。
（3）RT-PCR檢測(cè)：該技術(shù)可定量或半定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠組織或細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因特異表達(dá)的mRNA，且非常敏感，Northern 印跡未能檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄子，該技術(shù)亦可檢測(cè)到，甚至可測(cè)出1000個(gè)細(xì)胞中的一個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)錄子。其實(shí)驗(yàn)操作參見(jiàn)第三章第一、二節(jié)。
（4）Western 印跡分析：該技術(shù)通常用于轉(zhuǎn)基因小鼠組織或細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因編碼蛋白的表達(dá)水平。其實(shí)驗(yàn)操作參見(jiàn)第一章第十節(jié)。
（5）免疫組織化學(xué)分析：該法可檢測(cè)轉(zhuǎn)基因編碼蛋白表達(dá)在轉(zhuǎn)基因小鼠中的組織分布。有多種實(shí)驗(yàn)方法，可參看相關(guān)的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)書籍。
附錄：特殊實(shí)驗(yàn)溶液的配制
1. M16溶液：
稱取 0.5534 g NaCl，0.0356 g KCl，0.0162 g KH2PO4，0.0294 g MgSO4•7H2O， 0.0252 g CaCl2•2H2O，0.32 ml乳酸鈉(60% 糖漿)，0.0036 g丙酮酸鈉, 0.1000 g D-葡萄糖，0.0010 g酚紅，0.2106 g NaHCO3。溶于100ml超純水，0.22 m濾膜過(guò)濾除菌，分裝后40攝氏度儲(chǔ)存不超過(guò)3周，加入4 mg/mL BSA可立即使用。
2. M2 溶液：
稱取0.5534 g NaCl, 0.0356 g KCl, 0.0162 g KH2PO4, 0.0294 g MgSO4•7H2O,0.0252 g CaCl2•2H2O,0.32 ml 乳酸鈉(60% 糖漿), 0.0036 g丙酮酸鈉, 0.1000 g m?D-葡萄糖,0.0010g酚紅 0.0337g NaHCO3, 0.5000g HEPES。定容于100ml超純水，0.22 濾膜過(guò)濾除菌，分裝后40C儲(chǔ)存不超過(guò)3周。M2用于孵箱外卵的操作，用HEPES調(diào)節(jié)pH,加入4 mg/m BSA可立即使用。
3.工作液：
無(wú)丙酮酸鈉的高糖（4500 mg/mL）DMEM。具體配制見(jiàn)說(shuō)明書
4.注射緩沖液：
10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, 調(diào)節(jié)pH 為7.5.
轉(zhuǎn)基因小鼠制備的基本原理是將改建后的目的基因(或基因組片段)用顯微注射法注入供體小鼠的受精卵(或著床前胚胎細(xì)胞)，然后將此受精卵(或著床前胚胎細(xì)胞)再植入受體動(dòng)物的輸卵管(或子宮)中，使其發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，通過(guò)分析轉(zhuǎn)基因和實(shí)驗(yàn)小鼠表型的關(guān)系，研究揭示外源基因的功能，而且可進(jìn)行工程動(dòng)物的大量生產(chǎn)。
Gorden等報(bào)道了顯微注射法用于轉(zhuǎn)基因小鼠的制備。本法是最早，且應(yīng)用成功率較高的一種轉(zhuǎn)基因方法。其基本步驟如下：
1.同步獲得供體雌鼠（注射激素的雌鼠與正常雄鼠交配而得）和假孕受體母鼠（正常雌鼠與結(jié)扎雄鼠交配產(chǎn)生)。
2.供體鼠注射絨毛膜促性腺激素后，采集清晰的原核受精卵。
3.用顯微注射法將純化的外源基因注射進(jìn)受精卵的原核內(nèi)。
4.受精卵鑒定，將存活受精卵或存活胚胎移植到同步交配的假孕母鼠的輸卵管(或子宮)內(nèi)，飼養(yǎng)后鑒定是否受孕以及個(gè)體發(fā)育狀況。
5.子代鼠外源基因整合和表達(dá)的檢測(cè)。
6.轉(zhuǎn)基因小鼠品系的建立。
[優(yōu)點(diǎn)]
（1）外源基因在宿主染色體上的整合率相對(duì)較高；
（2）此法導(dǎo)入外源基因無(wú)需載體；
（3）轉(zhuǎn)基因小鼠得率在60%-80%；
（4）導(dǎo)入的外源基因可長(zhǎng)達(dá)50kb。
[不足之處]
（1）外源基因隨機(jī)整合；
（2）個(gè)別原核不清晰，需進(jìn)行特殊處理；
（3）需大型精密儀器，費(fèi)用昂貴；
（4）操作周期相對(duì)較長(zhǎng)。
實(shí)驗(yàn)器材的準(zhǔn)備
1.輸精管切除術(shù)用器材：彎式有齒鑷、直式有齒鑷、顯微鑷、手術(shù)剪、自動(dòng)小夾涂藥器、自動(dòng)小夾、帶彎針4/0絲線及持針器、直徑為10cm塑料 Petri氏培養(yǎng)皿（內(nèi)盛70%乙醇）。
2.手術(shù)前麻醉:2，2，2 三溴乙醇（阿佛?。┦窍喈?dāng)有效的麻醉劑。因該試劑對(duì)光敏感，所以應(yīng)該于4度避光保存，新試劑用前應(yīng)進(jìn)行測(cè)試。經(jīng)腹腔注射三溴乙醇麻醉小鼠后，為了使麻醉劑盡快發(fā)生作用，將小鼠放回原籠熟悉的環(huán)境中，小鼠將會(huì)更容易松馳下來(lái)。 擠壓小鼠腳墊，如果小鼠能感覺(jué)到此刺激，小鼠將從擠壓部位開(kāi)始縮腿運(yùn)動(dòng)（pedal reflex），用此方法可以檢察是否麻醉完全。實(shí)驗(yàn)中小鼠無(wú)縮腿運(yùn)動(dòng)、小鼠達(dá)到手術(shù)所需的麻醉深度以及程度方可開(kāi)始手術(shù)。
三溴乙醇的反復(fù)使用可能引起小鼠腹膜刺激征或者炎癥反應(yīng)。其他麻醉劑中，克他命/甲苯噻嗪在獸醫(yī)界廣泛應(yīng)用，另外，克他命/美托咪定也越來(lái)越受到青睞，特別是在美國(guó)。我國(guó)一些實(shí)驗(yàn)室用戊巴比妥鈉的效果好,特別是尾靜脈注射控制很方便.30g左右小鼠用0.85%的戊巴比妥鈉0.3ml左右。
3. 受精卵的采集用器材：70%乙醇、手術(shù)剪、10mL解剖剪、手術(shù)鑷、M2溶液（Sigma）、小玻璃皿等。
4. 離體輸卵管中受精卵收集用器材：二氧化碳孵育箱、眼科鑷子、5號(hào)鑷子、無(wú)菌30-mm組織培養(yǎng)皿、解剖顯微鏡、透明質(zhì)酸酶、移液管、工作液、M16溶液（Sigma）、3ml注射器等。
5. DNA顯微注射用器材
（1）受精卵的收集與移動(dòng)用器材：巴氏移液管、酒精燈、特制吸管、玻璃刀等。
（2）凹玻片準(zhǔn)備：一塊標(biāo)準(zhǔn)的凹型載玻片（硅化）、礦物油（Sigma）、工作液等。
（3）注射設(shè)備的設(shè)置：微型水力驅(qū)動(dòng)設(shè)備、Hamilton Gas-Tite™注射器（250 l）、Intramedic™管道系統(tǒng)（外徑1.27mm，內(nèi)徑0.86mm）、兩只玻璃管道連接頭、三通管連接器、一只帶接頭的60ml塑料注射器、一只器械套管、礦物油等。
（4）受精卵的顯微注射用器材：凹玻片（顯微注射用）、倒置立體相差顯微鏡l漢密爾頓注射器）、氣壓裝置(50ml充滿氣體的注射器)?或倒置Nomarski立體光學(xué)顯微鏡、顯微操縱器、千分尺（連接添滿礦物油，且耐氣構(gòu)造的250 、持卵管、預(yù)載DNA的注射針等。
6.輸卵管轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)備
（1）手術(shù)試劑器材：麻醉劑（阿佛丁或可他命/甲苯噻嗪）、70%乙醇、一副鈍性齒鑷、兩副5號(hào)精細(xì)鑷子、一副10cm手術(shù)剪、帶自動(dòng)小夾的金屬大剪、一個(gè)小彈簧夾、外科縫線、解剖顯微鏡、纖維光學(xué)照明器、載針頭的1ml注射器、kimwipe綿紙或外科紗布、9cm 塑料皿、工作液、移液管和手動(dòng)移卵管等。所有的手術(shù)器械在使用前應(yīng)該徹底清洗，70%乙醇消毒或高熱滅菌處理。
（2）受體母鼠的準(zhǔn)備：輸卵管轉(zhuǎn)移的受體鼠應(yīng)該為4-6周齡大小，體重在20-25克左右，嚴(yán)禁用低體重以及超重母鼠，若體重較低，其體能不足以維持妊娠，可能導(dǎo)致受精卵的重新吸收；若體重較重，麻醉劑被吸收入脂肪組織，降低麻醉效果，可能使手術(shù)困難，而且脂肪組織的存在意味著靜脈的存在，所以手術(shù)時(shí)切掉脂肪組織可能導(dǎo)致不必要的出血，難以確認(rèn)手術(shù)時(shí)的操作對(duì)象。出血也可能堵塞移卵管。選擇輸卵管轉(zhuǎn)移前一天晚上與切除輸精管小鼠交配的假孕母鼠，注射當(dāng)天早上母鼠可見(jiàn)精栓。盡管像Swiss Webster系的哺育母鼠很容易超重，隨著體重的增加，它們將表現(xiàn)出不同程度的感覺(jué)消失，但它們是優(yōu)良的哺育母鼠。另外，它們的價(jià)格也便宜。另一個(gè)成功的鼠系是B6D2F1，它們生命力強(qiáng)并有一定雜合優(yōu)勢(shì)。
（3）麻醉劑：阿佛丁被證明是輸卵管轉(zhuǎn)移手術(shù)的有效麻醉劑。
實(shí)驗(yàn)操作程序和方法
1．鼠系克隆
（1）動(dòng)情期的探測(cè)：在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立中母鼠動(dòng)情期的監(jiān)測(cè)有很高的技巧性。小鼠的動(dòng)情期主要?jiǎng)澐譃樗膫€(gè)時(shí)期：
① 動(dòng)情后期：陰道口無(wú)擴(kuò)張，周圍組織為灰白色，陰道口周圍無(wú)膨大
② 間情期：陰道開(kāi)口小，周圍組織為灰色或藍(lán)色
③ 動(dòng)情前期：陰道口逐漸擴(kuò)張，陰道周圍組織由粉紅色變?yōu)榧t色。
④ 動(dòng)情期：陰道周圍組織顏色由紅色轉(zhuǎn)為粉紅色，陰道口背側(cè)唇可見(jiàn)條紋，陰道口腹側(cè)唇可見(jiàn)腫大，陰道有分泌液外滲。
隨機(jī)選擇動(dòng)物，任何時(shí)間都可能有20%-25%的動(dòng)物處于動(dòng)情期。大多鼠科動(dòng)物的動(dòng)情期平均持續(xù)4-5天，所以對(duì)群居性動(dòng)物的個(gè)體進(jìn)行動(dòng)情周期的同步化處理后可能在任一時(shí)期產(chǎn)生大量發(fā)情動(dòng)物。動(dòng)情期動(dòng)物的選擇需兩個(gè)指標(biāo)：陰道周圍組織色澤和組織膨脹的程度。動(dòng)情期動(dòng)物陰道組織深粉紅色，但并不同于炎癥時(shí)的色澤。另外，陰道口周圍背腹部組織腫脹而有光澤，起初其腹部可見(jiàn)條紋。個(gè)別陰道口組織色澤較深，但無(wú)膨脹，或陰道口稍微擴(kuò)大且略帶灰色者為非動(dòng)情期動(dòng)物，切勿誤選它們用于交配。
（2）交配的確認(rèn)：陰栓形成。動(dòng)物合籠后，確定雄性個(gè)體是否與母鼠成功交配非常有必要。由于雄性精液可在陰道內(nèi)凝固成柔軟栓性物，成功交配后不久有陰道栓形成。以手的中指、小指和拇指捏住雌性尾根處，使小鼠頭部向下，仔細(xì)觀察陰道口部位，交配過(guò)的雌性小鼠可見(jiàn)有白色橡皮擦狀的陰道栓，易肉眼所見(jiàn)，難以確定時(shí)可用小探針檢查陰道深部是否有栓子存在。檢查陰栓應(yīng)在每天早上的早些時(shí)間，因?yàn)殡S著時(shí)間的推移，陰栓將被排出體外。
2．輸精管切除術(shù)：輸精管切除小鼠用于與晶胚轉(zhuǎn)移母鼠交配使母鼠假孕。小鼠6-8周齡進(jìn)行輸精管切除術(shù)，CD-1 B6D2F1(C57BL6 *DBA/2)或Swiss Webster系是通常的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。阿佛丁腹腔注射麻醉劑量為240mg/kg。
（1）稱重后麻醉小鼠，背位固定小鼠，大剪刀貼近皮膚剪毛，70%的乙醇涂 搽消毒手術(shù)切口部位，以防止毛發(fā)污染切口。
（2）于生殖器前方大約1.3cm處橫行剪開(kāi)下腹部皮膚，作約1cm的切口， 用浸70%乙醇的紗布搽拭切口部位以清理毛發(fā)。
（3）切開(kāi)腹膜，進(jìn)行膀胱定位。每側(cè)都可見(jiàn)有一條管道走行，用鑷子輕輕夾持左側(cè)管道，提起部分使手術(shù)視野清晰可見(jiàn)，確定其為輸精管。
（4）將鑷子插進(jìn)輸精管下方，使它們處于自然狀態(tài)，其末端垂直。同時(shí)在該位置兩端用縫線結(jié)扎輸精管，距離大約4-5毫米。在兩結(jié)扎點(diǎn)間剪斷輸精管，置其于紗布上確定此側(cè)手術(shù)完畢。
（5）將輸精管兩個(gè)斷端輕輕放回腹腔，如上處理右側(cè)輸精管。兩側(cè)手術(shù)完畢后，2-3根單獨(dú)縫線縫合腹壁切口。待用縫線須浸泡在70%乙醇中，保持縫線濕潤(rùn)，防止結(jié)扎時(shí)粘附組織。用兩個(gè)或三個(gè)自動(dòng)小夾夾閉皮膚。
（6）為保暖包裹小鼠于紗布中或?qū)⑵浞胖糜跓釅|內(nèi)使其蘇醒，處于麻醉狀態(tài)下的小鼠應(yīng)該嚴(yán)格監(jiān)護(hù)直到其完全蘇醒。手術(shù)后小鼠飼養(yǎng)2周后確定手術(shù)是否成功。
（7）實(shí)驗(yàn)性飼養(yǎng)：將1-2只母鼠與輸精管切除小鼠合籠飼養(yǎng)，次晨進(jìn)行陰道栓檢查。有陰道栓的母鼠，用磷酸緩沖液處理后24小時(shí)，其輸卵管潮紅。卵細(xì)胞應(yīng)該處于單細(xì)胞期或未受孕狀態(tài)，若處于雙細(xì)胞期，則輸精管切除未完全，雄性小鼠應(yīng)進(jìn)行再篩選。
3．受精卵的收集
（1）受精卵的采集：受精卵獲得的方法分自然排卵和激素誘發(fā)排卵以及體外受精三種方法。本章對(duì)誘發(fā)排卵法給予介紹。
誘發(fā)排卵法：雌性小鼠生后6—8周達(dá)到性成熟，性周期均為4—5 日，其排卵時(shí)間可用飼養(yǎng)室的明亮和黑暗進(jìn)行調(diào)節(jié)，所以必須對(duì)飼養(yǎng)室的明暗規(guī)律進(jìn)行準(zhǔn)確嚴(yán)格地管理。
性周期是卵泡刺激素和黃體生成素相互作用的結(jié)果，我們可以從外部給予這些激素誘發(fā)排卵。向成熟雌小鼠腹腔內(nèi)注射5國(guó)際單位(IU)的孕馬血清促性腺激素(PMSG)之后，約在48—54h后再將2.5-5.0 IU的人絨毛膜促性腺激素(hCG)注射于同一小鼠腹腔內(nèi)，約12h后即可誘發(fā)排卵。排卵數(shù)量可達(dá)自然排卵的2倍，效果很好。雌小鼠給予hCG后應(yīng)立刻與雄性合籠。成熟雄小鼠應(yīng)按每籠飼養(yǎng)1只，雄性小鼠大小在12周齡到1年。合籠時(shí)，須將激素化雌性小鼠放進(jìn)雄小鼠的籠中。雄小鼠釋放促雌性發(fā)情的外激素，在交配過(guò)程中建議不換籠，交配過(guò)的雄小鼠，間隔一周后才進(jìn)行下次交配。
顯微注射的受精卵最好于交配后次晨注射前幾小時(shí)收集，此時(shí)易進(jìn)行注射操作。交配后過(guò)夜小鼠的陰道栓易見(jiàn)，可用交配指示劑指示。對(duì)超排卵的交配母鼠體內(nèi)進(jìn)行陰道栓計(jì)數(shù)一般正常。低比率的有栓母鼠說(shuō)明促性腺激素失去效力或雄性小鼠交配過(guò)度或雄性小鼠老齡化。收獲受精卵必須打開(kāi)小鼠腹腔，輸卵管必須仔細(xì)切開(kāi)。輸卵管沖洗術(shù)或輸卵管壺部切開(kāi)術(shù)都可作為收集受精卵的方法。
（2）腹腔內(nèi)輸卵管的切開(kāi)
1）通過(guò)斷頸或二氧化碳吸入快速處死小鼠。
2）將動(dòng)物背位固定在無(wú)菌干燥的吸水紙上，剪毛并用70%的乙醇徹底涂搽手術(shù)部位。以避免毛發(fā)污染手術(shù)視野。
3）持眼科鑷捏緊下腹部正中線皮膚，用外科剪作小的橫切口，剪刀鈍性分離充分暴露手術(shù)視野，或鈍性撕開(kāi)皮膚暴露腹膜。用眼科剪打開(kāi)腹膜，充分暴露腹腔與子宮角部手術(shù)視野。子宮為Y形，為起自盆腔膀胱后的肌性器官，向上分支為兩側(cè)子宮角，向上橫行深入腹腔。
4）用鑷子距輸卵管卵巢6-7mm處夾持子宮角翻轉(zhuǎn)后輕輕拖出腹腔，在鑷子捏點(diǎn)下部子宮角下方附近刺破腸系膜，清除腸系膜組織遠(yuǎn)離子宮角與輸卵管，并防止用力過(guò)大壓破子宮角與輸卵管連接處。
5）用鑷子拖出脂肪墊，卵巢，輸卵管以及子宮部件。小心剪掉卵巢與輸卵管之間的薄層膜，然后剪下輸卵管和部分子宮角，將其盛放在盛工作液的小玻璃皿中，對(duì)另一側(cè)輸卵管重復(fù)上面操作，完畢后如上處理下一只動(dòng)物。
（3）離體輸卵管內(nèi)受精卵的收集：解剖鏡下觀察近輸卵管漏斗部上部明顯潮紅此為壺腹部。用眼科鑷子撕開(kāi)膨大的壺腹部即看到包繞受精卵的丘細(xì)胞團(tuán)。
1）轉(zhuǎn)移輸卵管于含工作液的小玻璃皿中。
2）眼科鑷子夾持壺腹部，并用另一只眼科鑷子撕開(kāi)膨大的輸卵管，游離的受精卵慢慢流出，也可以用鑷子輕輕擠壓輸卵管將受精卵推出裂口。
（4）透明質(zhì)酸酶處理與受精卵的漂洗
工作液中受精卵可能成團(tuán)狀，微注射用的受精卵必須是單個(gè)細(xì)胞，而且無(wú)細(xì)胞碎片。漂洗細(xì)胞時(shí)，首先用工作液除去細(xì)胞碎片。不成團(tuán)細(xì)胞可用無(wú)菌移液管收集到盛工作液的玻璃小皿中，注意把握移液管的張力。溶解在工作液中的透明質(zhì)酸酶對(duì)細(xì)胞團(tuán)以及復(fù)合體進(jìn)行消化時(shí)必須嚴(yán)密觀察，一旦細(xì)胞團(tuán)溶解立即將單細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮工作液中，防止消化過(guò)度。
用工作液漂洗2-3次，清除碎片后，用無(wú)菌移液管將受精卵置于特殊培養(yǎng)基（M16），放于37CO2孵箱中待注射，此培養(yǎng)基上層覆蓋高壓消毒礦物油，可防止污染同時(shí)防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)影響pH。受精卵在體外發(fā)育較體內(nèi)快，在孵育過(guò)程中注意觀察一些受精卵清晰可見(jiàn)原核形成，在此期間可先選出原核清晰的卵(形態(tài)稍不規(guī)則)用于注射，其它卵繼續(xù)培養(yǎng)。注射后，再篩選，再注射，直至得到滿意的注射卵數(shù)。
4．顯微注射
（1）導(dǎo)入DNA的制備：顯微注射首先涉及導(dǎo)入DNA的制備，顯微注射的轉(zhuǎn)入基因通常為去除載體序列的線狀DNA，轉(zhuǎn)基因所用載體是真核表達(dá)載體，即含有在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的真核啟動(dòng)子。所謂組織特異性的實(shí)現(xiàn)多是通過(guò)組織特異性啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)組織特異性表達(dá)的。制備轉(zhuǎn)基因小鼠，必須對(duì)待導(dǎo)入DNA進(jìn)行分離純化。實(shí)驗(yàn)必須用經(jīng)過(guò)瓊脂糖電泳鑒定并確定其純度的DNA，對(duì)導(dǎo)入基因的大小沒(méi)有特別的限制，長(zhǎng)鏈DNA也可成功。 實(shí)驗(yàn)中注意防止一些雜質(zhì)堵塞注射針，如瓊脂糖顆粒、纖維物質(zhì)等，需盡量超速離心除去。
DNA的注射質(zhì)量是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。研究表明DNA注射的起始濃度大約在1ng/ml，當(dāng)DNA注射濃度超過(guò)一定上限時(shí)，實(shí)驗(yàn)效果不佳，而且大于5 ng/ml會(huì)產(chǎn)生明顯的毒性作用。
導(dǎo)入DNA的制備程序如下：
1）通過(guò)在Tris/acetate/EDTA緩沖液中進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳從載體中分離待插入DNA，用5mg/ml溴乙啶染色。
2）為防止對(duì)插入DNA的溴乙啶的破壞，用長(zhǎng)波紫外光顯影。
3）切下目的基因所在凝膠片，電泳制備目的DNA，或用Qiaex凝膠抽提試劑盒進(jìn)行抽提。
4）乙醇沉淀目的DNA。在樣品中加入1/10體積的3M乙酸鈉，混勻，再加入2-2.5倍體積無(wú)菌100%乙醇進(jìn)行沉淀。
5）-200C 孵育過(guò)夜后，超速離心機(jī)10000轉(zhuǎn)/分，離心5分，收集沉淀，重懸沉淀于Elutip緩沖液。
6）用Elutip-D微型柱對(duì)目的DNA過(guò)柱處理。
7）按照步驟4重新沉淀DNA，用70%乙醇漂洗沉淀2-3次，真空干燥沉淀。清洗與干燥過(guò)程極其重要，因?yàn)闅堄嗟柠}和乙醇對(duì)受精卵的發(fā)育是致命的。
8）注射緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, pH 7.5）重懸沉淀，緩沖液必須是Milli-Q純化水配制
9）通過(guò)熒光光度計(jì)或凝膠電泳比色法評(píng)估目的DNA的濃度l.μ
10）用注射緩沖液調(diào)整目的DNA的濃度在5-10ng/
（2）器械準(zhǔn)備
[注射針的制作]
注射針是內(nèi)含玻璃細(xì)絲的薄壁毛細(xì)吸管，它可以通過(guò)毛細(xì)管虹吸作用進(jìn)行載樣。用拉針儀（SUTTER,P2000 laser based micropipette puller,具體操作程序詳見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書）可以把注射針?biāo)交虼怪背断聛?lái)。必須保證制備的毛細(xì)管可以進(jìn)入拉針儀這樣加熱組件大約在毛細(xì)管的中央位置。一般用內(nèi)徑為1.0mm的微電極管為材料制作注射針,微電極管可以買到,它與拉針儀是匹配的。另外，應(yīng)該對(duì)拉針儀的設(shè)置進(jìn)行選擇，使細(xì)絲溫度和扯拉力度(主拉力和次拉力)將處于最佳狀態(tài)。具體需要預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定其最佳設(shè)置。待用注射針應(yīng)該用蒸餾水嚴(yán)格清洗以除去殘留炭化物顆粒。嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)微電極管在使用前應(yīng)經(jīng)過(guò)泡酸、泡蒸餾水和硅化的程序,但有人省略了此步也有較好的結(jié)果,經(jīng)拉針儀拉針后就沒(méi)法清洗,好的拉針儀是不會(huì)殘留炭化物顆粒,若拉成后清洗其針尖很容易斷掉,可用Narishige Japan model PN-30。
[持卵管制作]
m左右,內(nèi)徑要能吸住受精卵,而又不把卵吸入管內(nèi)。為便于操作，持卵管可進(jìn)一步調(diào)整使其末端輕微彎曲（15度）。?m。持卵管的內(nèi)徑很重要,可用鉑金燈絲灼燒管口,使其內(nèi)徑為30-50?為避免機(jī)械損傷，持卵管口應(yīng)該是鈍性末端而且其孔隙有限，使受精卵輕輕依附在負(fù)壓管道中。這種高度密實(shí)可抵抗密封系統(tǒng)的破損，而密封可以減少受精卵注射時(shí)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。持卵管的口部應(yīng)該光滑，平整及與其長(zhǎng)軸垂直。具體制備操作：雙手執(zhí)毛細(xì)玻璃管的兩端，將管的中部置酒精燈外焰燒紅至變軟后離開(kāi)火焰，同時(shí)雙手外伸，將燒軟的部分拉細(xì)。用玻璃刀或細(xì)沙輪小心將細(xì)管切開(kāi)，在鏡下觀察切口應(yīng)平齊(如不平齊，應(yīng)重新切割)。然后于酒精燈火焰底部的藍(lán)焰邊緣處將切口鈍化處理(即將管口于藍(lán)焰邊緣處做短暫灼燒，然后于顯微鏡下檢查管口形狀，如此反復(fù)，直至滿意)。如實(shí)驗(yàn)室配有持卵管制作儀，則可在顯微鏡下直接監(jiān)視熱燈絲對(duì)持卵管管口灼燒后的形狀，及時(shí)調(diào)整二者之間的相對(duì)位置，更易得到滿意的持卵管。持卵管應(yīng)該做調(diào)整，用熔斷儀將其打彎使其末端成15度(不同的顯微注射儀度數(shù)可能有差異,打彎成25度左右,一般為20-25度)輕微彎曲以方便使用。此持卵管為不含細(xì)絲的玻璃，顯微鏡下用含刻度目鏡確定持卵管的外徑應(yīng)該為100-140
[洗卵管制作]
1）點(diǎn)燃酒精燈，調(diào)節(jié)火焰到最佳。捏持玻璃毛細(xì)吸管或巴氏移液管在火焰上焰旋轉(zhuǎn)過(guò)火。
2）l的吸管。注意制備過(guò)程中離開(kāi)火焰的時(shí)間以及扯拉的力度，盡量保證制備吸管的一致性。?當(dāng)吸管開(kāi)始變軟，快速撤離火焰，向外急劇扯拉使吸管變長(zhǎng)，形成口徑大約200
3）為吸管評(píng)分，輕柔地折斷吸管，辨別其聲音是否清脆，或扯拉吸管或只做彎曲直到兩根同分?jǐn)?shù)的吸管斷裂為止。
4）解剖鏡下(要在熔斷儀上)檢查吸管，并對(duì)其進(jìn)行調(diào)整，確定其口徑以及管口光滑平整。
[移卵管的制作]
用于轉(zhuǎn)移注射后受精卵到假孕鼠體內(nèi)的吸管制作過(guò)程同上洗卵管。不同的是，這些吸管的口徑稍微小一些，大約150 m(150-160m)，直徑比單受精卵的口徑略大一些，將促使卵細(xì)胞精細(xì)的充滿移卵管并轉(zhuǎn)移到輸卵管。移卵管在打磨過(guò)程中要求管口更光滑平整以減輕插入輸卵管時(shí)對(duì)輸卵管的損傷，同時(shí)必須注意移卵管頭在火焰上時(shí)間不可太長(zhǎng)，防止融化堵塞。管口要平且要鈍化。
[凹玻片的準(zhǔn)備]
必須準(zhǔn)備適合承載用于微注射的受精卵的凹玻片做微注射槽，也可用培養(yǎng)皿做注射槽，載玻片上的受精卵應(yīng)該浸潤(rùn)在pH緩沖工作液中，如M2溶液，使受精卵在孵箱外保持30-40分能受到保護(hù)。具體凹玻片的準(zhǔn)備程序如下：
1）在超凈臺(tái)內(nèi)利用手動(dòng)移液器將M2溶液加入凹玻片窩的基底部形成直徑大約0.6cm液面，液滴的液面要水平平整，避免液體的折射效應(yīng)。吸取胚胎實(shí)驗(yàn)用礦物油于M2溶液上，礦物油的量以剛剛達(dá)M2溶液最高液面為宜，將凹玻片置于倒置顯微鏡的載物臺(tái)上，在低倍鏡下調(diào)節(jié)焦距，使M2溶液液滴的底面清楚為止。
2）覆蓋礦物油的作用：防止液滴脫水以及濃縮；使受精卵處于無(wú)菌狀態(tài)；固定M2溶液液滴。
3）從孵箱中取出受精卵，用移卵管吸出受精卵并用M2溶液洗滌2-3次，調(diào)整實(shí)驗(yàn)用量，將其置于凹玻片的M2溶液中，調(diào)焦使在低倍鏡下清楚地看到受精卵的輪廓，并且保證受精卵有足夠空間自由移動(dòng)，用持卵器將卵匯聚到一起，移卵時(shí)注意不要將氣泡移入，影響操作視野。
[顯微注射設(shè)備]
顯微注射儀的基本工作原理是運(yùn)用立體倒置相差顯微鏡進(jìn)行觀察監(jiān)測(cè)，顯微鏡兩側(cè)各置一臺(tái)顯微操作儀，一側(cè)接持卵管，另一側(cè)接注射針，可調(diào)節(jié)持卵管或注射針的空間位置。持卵管通過(guò)塑料管連接一個(gè)裝滿礦物油的帶微調(diào)的注射器，通過(guò)調(diào)節(jié)壓力控制卵的運(yùn)動(dòng)。注射針通過(guò)塑料管連接有壓力泵的注射儀。將注射時(shí)間與壓力固定后，進(jìn)行注射操作。操作系統(tǒng)有LEICA AS TP基因轉(zhuǎn)殖操作系統(tǒng)（major instruments.co.Ltd）等，具體操作程序按其說(shuō)明書嚴(yán)格進(jìn)行。
（3）注射針內(nèi)DNA的裝載
把注射針的鈍性頭浸在盛待注射DNA的管中，溶液通過(guò)毛細(xì)吸管的虹吸作用進(jìn)入注射針。注射針的末端應(yīng)該一直留在DNA溶液中直到注射針末端有小泡形成。這說(shuō)明DNA溶液裝載完畢。仔細(xì)檢查注射針針頭末端，距其幾毫米處可見(jiàn)一個(gè)小凹液面。最后可將載滿DNA溶液的吸管裝在持針器或固定在器械環(huán)中待用。
（4）受精卵的顯微注射
受精卵的顯微注射過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，制作大量樣品過(guò)程中，為保證顯微注射量的一致性，必須通過(guò)大量反復(fù)有效的練習(xí)才可以成功。
1）置凹玻片于顯微鏡下，低倍聚焦。
2）調(diào)節(jié)持卵管，注射針與受精卵在同一視野下后，轉(zhuǎn)換到高倍鏡（32X）下時(shí)位置稍微低于受精卵，以便自如地操作受精卵。
3）挨近注射針到工作液或油界邊緣，稍微進(jìn)入油界。在注射前，增加注射針的壓力可見(jiàn)DNA溶液泡在油內(nèi)形成囊狀，以此確定DNA溶液流存在。
4）如果未見(jiàn)DNA溶液流，則輕輕摩擦持樣器鈍緣，漸漸的打開(kāi)注射器針頭。針頭重新進(jìn)入油內(nèi)確定DNA溶液流的存在。
5）移動(dòng)持卵管回到受精卵下部。通過(guò)微分驅(qū)動(dòng)水壓控制系統(tǒng)使持卵管內(nèi)產(chǎn)生溫和的負(fù)壓，并使持卵管末端吸住受精卵。此操作必須確保受精卵基底部與凹玻片基底部輕輕接觸。注意不宜吸得過(guò)緊，否則會(huì)使卵變形，甚至?xí)⒙盐顺致哑鲀?nèi)。
6）對(duì)持卵管內(nèi)真空進(jìn)行緩慢調(diào)節(jié)，使持卵管內(nèi)受精卵輕柔地旋轉(zhuǎn)，使卵內(nèi)原核位于持卵管口的遠(yuǎn)側(cè)端。
7）維持持卵管穩(wěn)定，使注射針的針頭緊靠受精卵的透明帶，進(jìn)行調(diào)節(jié)并使針與原核處于同一平面上。用注射針依次刺破透明帶，細(xì)胞外膜，前核核膜，進(jìn)入核膜內(nèi)，受精卵的透明帶易被針尖刺破，前核核膜相當(dāng)有彈性，應(yīng)用不同的方法進(jìn)行嘗試突破此結(jié)構(gòu)。操作時(shí)避免與核接觸損傷核仁。
8）保持注射針位置固定，輕輕增加壓力使DNA溶液流入前核中。注射過(guò)程中可能出現(xiàn)的現(xiàn)象如下：
① 注射后原核將膨大到原來(lái)的兩倍左右，表明注射成功，然后直接抽出注射針。
② 一氣泡出現(xiàn)在注射針尖端，透明帶可能膨脹，表明受精卵的膜非常艱固，沒(méi)有被刺破，此時(shí)需繼續(xù)向內(nèi)進(jìn)針，直到尖端進(jìn)入核，同時(shí)要小心注射針尖端極易破損。
③ 注射針壓力較大，看不到任何現(xiàn)象，可能是注射針堵塞，需換針或更換DNA溶液。
④ 若見(jiàn)胞質(zhì)顆粒涌出到卵黃周圍空間，說(shuō)明受精卵破裂。注射過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)卵破裂數(shù)目較多，則需更換注射針。一支注射針一般可注射5—10枚卵。
9）用持卵器移動(dòng)受精卵到凹玻片凹內(nèi)相對(duì)隔離的位置，以區(qū)分注射組與非注射組。重新安裝持卵管并進(jìn)行下一組操作。
5．受精卵的輸卵管轉(zhuǎn)移
（1）受精卵的輸卵管注射
1）將麻醉小鼠放置于一塑料平皿蓋上，固定小鼠牙齒于皿緣以確保小鼠氣道通暢。用70%乙醇涂搽切口部位。也可預(yù)先在手術(shù)部位剔除毛發(fā)。
2）將受精卵從培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至工作液內(nèi)。因受精卵在轉(zhuǎn)移過(guò)程中在孵箱外操作，所以應(yīng)該將其從培養(yǎng)基中移到工作液中。
4）用移卵管裝載受精卵。移卵管的正確裝載對(duì)輸卵管轉(zhuǎn)移的成功非常重要。如圖11-1所示，吸取一定量的工作液在移卵管尖端，然后吸取些許空氣制成一個(gè)小氣泡。再吸取與氣泡體積大約相當(dāng)?shù)墓ぷ饕海o接著在吸取另外一個(gè)小氣泡。收集受精卵于盡可能小容積的工作液中，將其線形排列于移卵管中。當(dāng)所有的卵被負(fù)載后，再吸取小量氣體制成小氣泡，接著吸取最終容量的工作液。氣泡將有利于對(duì)壓力進(jìn)行調(diào)節(jié)，更容易使卵移動(dòng)。
5）手術(shù)暴露輸卵管復(fù)合體。如圖所示，在離中線約0.5厘米、背駝峰與后腿髖關(guān)節(jié)之間作橫行切口。仔細(xì)用浸70%乙醇涂搽切口部位，并搽去毛發(fā)。捏住一側(cè)切口皮膚，鈍性分離皮下組織。移動(dòng)皮膚直到腹壁神經(jīng)走行清晰可見(jiàn)。這時(shí)可看到腹壁下紅色卵巢或淺色卵巢脂肪墊。用眼科鑷捏住腹壁，并作約0.5厘米橫行切口，鈍性分離組織，輕輕移出脂肪墊、卵巢、輸卵管以及子宮。用彈簧夾夾住脂肪墊并保持子宮在適當(dāng)位置。若子宮及子宮角頻繁滑回腹腔，在保證氣道通暢的前提下，可適當(dāng)重新布置其位置。
6）輕輕移動(dòng)塑料平皿，使小鼠位于解剖顯微鏡下，適當(dāng)調(diào)節(jié)顯微鏡及小鼠位置使其輸卵管卷曲部清晰可見(jiàn)。
7）用眼科鑷于漏斗部透明囊膜處鈍性撕開(kāi)小口，并防止撕裂血管，引起出血。必要是撕裂口部位局部應(yīng)用腎上腺素以減少出血，并用紗布擦拭保持操作視野干凈。
8）一旦漏斗部清晰可見(jiàn)，用鑷子夾持其邊緣并充分暴露漏斗管口。在避免壺腹損傷的前提下，盡可能插入移卵管。
9）在壓力可調(diào)節(jié)的前提下，輕輕把卵吸吹進(jìn)入漏斗部。氣泡可以阻止卵回流而且很容易使卵進(jìn)入輸卵管漏斗管。若吹卵的壓力太大，那么移卵管口可能抵在輸卵管壁上，這時(shí)可稍微后撤移卵管再進(jìn)行操作，也可能由于血塊堵塞移卵管，若這樣，則應(yīng)該吹出細(xì)胞在培養(yǎng)皿中，重新吸卵。
10）移卵操作完成后，撤回移卵管，去除器械，按原本位置將各器官重置于腹腔內(nèi)。
10）縫合切口，用小夾夾持皮膚。常用自動(dòng)小夾代替縫線，這樣可以避免小鼠啃嘶縫線，切口裂開(kāi)。
11）若進(jìn)行雙側(cè)手術(shù)，則于另一側(cè)子宮角重復(fù)上述操作。
12）手術(shù)完成后，安置小鼠于清潔的籠中。麻醉狀態(tài)下，小型哺乳動(dòng)物無(wú)法有效維持機(jī)體溫度。所以應(yīng)該注意小鼠的保溫?？梢杂脽釅|保持其溫度直到動(dòng)物蘇醒。所有的動(dòng)物在回籠前20-30分可蘇醒。由于妊娠很容易使受體母鼠產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致流產(chǎn)或食子，所以對(duì)受體母鼠必須嚴(yán)格監(jiān)護(hù)。
（2）注射后期監(jiān)護(hù)：手術(shù)后嚴(yán)格監(jiān)護(hù)防止并發(fā)癥的發(fā)生非常重要。麻醉易誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)血壓升高，所以手術(shù)后必須嚴(yán)密監(jiān)護(hù)至少2小時(shí)，同時(shí)推薦進(jìn)行保溫處理。
處于麻醉狀態(tài)的小鼠應(yīng)該用軟紗布包裹，而且籠中加墊草墊以及軟材料，并保持鼠籠溫度。正常體溫的維持可以縮短動(dòng)物處于麻醉狀態(tài)的時(shí)間。
手術(shù)后小鼠常規(guī)4-5天觀察一次以確保小鼠處于恢復(fù)中，清醒小鼠應(yīng)活動(dòng)自如。腹腔手術(shù)后小鼠有發(fā)生腸疝的可能。所以手術(shù)時(shí)保持切口盡量小，縫合嚴(yán)密，而組織膠水的正確應(yīng)用可以避免此類并發(fā)癥的發(fā)生。皮膚必須用縫線或不銹剛夾夾閉，手術(shù)后1-2周可拔除。如果動(dòng)物狀態(tài)不良，表現(xiàn)厭食，脫水，或明顯弓背，通過(guò)動(dòng)物飲水可給予羥苯基乙酰胺以及同類止疼藥。若發(fā)生脫水，可腹腔注射0.9%生理鹽水或林格氏液。若仍無(wú)改善可在麻醉狀態(tài)下重新打開(kāi)手切口確認(rèn)是否有疝發(fā)生。若動(dòng)物狀態(tài)無(wú)明顯好轉(zhuǎn)，最終采用安樂(lè)死進(jìn)行。
轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
產(chǎn)出的鼠仔中，屬轉(zhuǎn)基因小鼠者，約占全部仔小鼠的20％-30％。因此，對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠必須進(jìn)行鑒定篩選。
1．轉(zhuǎn)基因整合檢測(cè)
鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠最簡(jiǎn)單的方法是從小鼠尾尖提取基因組DNA，檢測(cè)其基因型。檢測(cè)方法包括PCR和Shouthern雜交。
（1）基因組DNA的提?。?br /> 1）將離乳期小鼠（>4周齡）麻醉標(biāo)記。
2）用一只手抓住小鼠，另一只手持消毒剪剪下約1cm的鼠尾。
3）將剪下的鼠尾放入500l消化緩沖液中（50mmol/L Tris-HCl, pH8.0; 100mmol/LEDTA; 100mmol/LNaCl; 1%SDS）, 并加入蛋白酶K使其終濃度為100g/ml，550攝氏度下震蕩孵育3~4小時(shí)或過(guò)夜孵育。
4）加入5lRNA酶A，370C孵育1~2小時(shí)。
5）DNA的分離純化步驟參見(jiàn)第一章的第三節(jié)。
（2）PCR檢測(cè)：轉(zhuǎn)基因的初始篩選通常采用PCR檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便、快速、費(fèi)用低而有效，適合大量標(biāo)本的分析。由于該技術(shù)特別敏感，可能產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。因此，在操作過(guò)程中必須特別小心，避免質(zhì)粒DNA或其它標(biāo)本的基因組DNA的污染。假陽(yáng)性的產(chǎn)生對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠的篩選工作將是致命的。PCR實(shí)驗(yàn)應(yīng)采用雙復(fù)管，甚至三復(fù)管。陽(yáng)性結(jié)果最好用Southern雜交技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)。PCR的實(shí)驗(yàn)操作參見(jiàn)第一章的第六節(jié)。
（3）Southern blot分析：該技術(shù)雖然沒(méi)有PCR技術(shù)那樣敏感，且費(fèi)力費(fèi)時(shí)，但是避免了因污染導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的麻煩，可以得到目的基因整合后的基因組、整合位點(diǎn)數(shù)目、轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)等的確切信息。Southern blot的實(shí)驗(yàn)操作參見(jiàn)第一章的第八節(jié)。
2．轉(zhuǎn)基因表達(dá)檢測(cè)
轉(zhuǎn)基因整合檢測(cè)是確定目的基因是否整合到了小鼠的基因組中，同時(shí)可確定整合的位點(diǎn)和拷貝數(shù)，這在遺傳學(xué)上是十分重要的。而轉(zhuǎn)基因表達(dá)檢測(cè)是確定目的基因在轉(zhuǎn)基因小鼠器官組織中表達(dá)的時(shí)空分布。其檢測(cè)包括RNA分析技術(shù)和蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)。
（1）RNA的分離：根據(jù)實(shí)驗(yàn)者的需要從轉(zhuǎn)基因小鼠組織或細(xì)胞中提取總RNA或mRNA。分離總RNA比較簡(jiǎn)單，且適合做基因做基因轉(zhuǎn)錄分析。實(shí)驗(yàn)操作參見(jiàn)第一章的第四節(jié)。
（2）Northern 印跡分析：該技術(shù)用于定性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物組織或細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄的相對(duì)水平。其實(shí)驗(yàn)操作參見(jiàn)第一章的第九節(jié)。
（3）RT-PCR檢測(cè)：該技術(shù)可定量或半定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠組織或細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因特異表達(dá)的mRNA，且非常敏感，Northern 印跡未能檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄子，該技術(shù)亦可檢測(cè)到，甚至可測(cè)出1000個(gè)細(xì)胞中的一個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)錄子。其實(shí)驗(yàn)操作參見(jiàn)第三章第一、二節(jié)。
（4）Western 印跡分析：該技術(shù)通常用于轉(zhuǎn)基因小鼠組織或細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因編碼蛋白的表達(dá)水平。其實(shí)驗(yàn)操作參見(jiàn)第一章第十節(jié)。
（5）免疫組織化學(xué)分析：該法可檢測(cè)轉(zhuǎn)基因編碼蛋白表達(dá)在轉(zhuǎn)基因小鼠中的組織分布。有多種實(shí)驗(yàn)方法，可參看相關(guān)的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)書籍。
附錄：特殊實(shí)驗(yàn)溶液的配制
1. M16溶液：
稱取 0.5534 g NaCl，0.0356 g KCl，0.0162 g KH2PO4，0.0294 g MgSO4•7H2O， 0.0252 g CaCl2•2H2O，0.32 ml乳酸鈉(60% 糖漿)，0.0036 g丙酮酸鈉, 0.1000 g D-葡萄糖，0.0010 g酚紅，0.2106 g NaHCO3。溶于100ml超純水，0.22 m濾膜過(guò)濾除菌，分裝后40攝氏度儲(chǔ)存不超過(guò)3周，加入4 mg/mL BSA可立即使用。
2. M2 溶液：
稱取0.5534 g NaCl, 0.0356 g KCl, 0.0162 g KH2PO4, 0.0294 g MgSO4•7H2O,0.0252 g CaCl2•2H2O,0.32 ml 乳酸鈉(60% 糖漿), 0.0036 g丙酮酸鈉, 0.1000 g m?D-葡萄糖,0.0010g酚紅 0.0337g NaHCO3, 0.5000g HEPES。定容于100ml超純水，0.22 濾膜過(guò)濾除菌，分裝后40C儲(chǔ)存不超過(guò)3周。M2用于孵箱外卵的操作，用HEPES調(diào)節(jié)pH,加入4 mg/m BSA可立即使用。
3.工作液：
無(wú)丙酮酸鈉的高糖（4500 mg/mL）DMEM。具體配制見(jiàn)說(shuō)明書
4.注射緩沖液：
10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, 調(diào)節(jié)pH 為7.5.
